الطرق السيرولوجية لفحص وتشخيص فيروسات النبات

علم السيرولوجي ببساطة هو العلم الذي يدرس العلاقة ما بين الانتيجين و والاجسام المضادة والتفاعلات الحادثة بينهما
ما الفرق بين الانتيجين والهابتين ANTIGEN - HAPTEN
الانتيجين عبارة عن مادة بروتينية تؤدي الى انتاج اجسام مضادة في جسم الحيوان المحقون بها كما انها لها القدرة على التفاعل معه وهي تحوي البروتين وعديدات التسكر والدهون وغيرها
اما الهابتين فهولا يكون اجسام مضادة عند حقنه ولكنه له نشاط سيرولوجي في انبوب الاختبار ومنه نوعان هابتين معقد وهابتين بسيط المعقد له القدرة على الاتحاد مع الاجسام المضادة و تعطي راسب او تفاعل جزئي اما البسيط فلا يكون راسب بل يمنع الترسيب باتحاده مع الجسم المضاد

القدرة الانتيجينية للفيروس النباتي :
يعتبر البروتين وخاصة المنطقة الخارجية منه هو الجزء النشط انتيجينيا اما الحامض النووي فربما يزيد القدرة على انتاج الاجسام المضادة

الاجسام المضادة ANTIBODIES
جلوبيولينات خاصة مناعية IMMUNOGLOBULIN أي تتفاعل مع الانتيجين واهمها والاكثر استخداما هو من طراز جاما أي IGG

الاختبارات السيرولوجية : واهم هذه الطرق ما يلي /

1- اختبار التجمع: Agglutination Test

2- اختبار الترسيب Precipitation Test
  أ - الترسيب في الأنابيب Tube Precipitation Test.
  ب- الترسيب الدقيق Micro Precipitation Test.

3- الانتشار المزدوج في الأجار Agar Double Diffusion Test

4-  ELISA : Enzyme linked Immunosorbent Assayطريقة الإنزيم المرتبط.
و هي الطريقة الاحدث والاحسن لما يلي:
 • اكثر حساسية من كل الطرق السيرولوجية السابقة حيث يتم باستخدامها الكشف عن الفيروسات الموجودة بتركيز صغير او منخفض في النبات المصاب
 • تتم العملية باستخدام كمية صغيرة جدا من الاجسام المضادة
 • سهل الاجراء رغم خطواته العديده
 • يمكن ان يتم الفحص على عدد كبير من العينات

5 – الكشف سيرولوجيا باستخدام الميكروسكوب الالكتروني :

و الطرق السيرولوجية عموما لها ميزات عديدة اهمها
• يمكننا الاحتفاظ بالاجسام المضادة لفترات طويلة حيث يمكننا الاحتفاظ به لمدة عام في الثلاجة العادية
•  يمكننا الكشف عن المرض قبل ظهور اعراضه
• يمكننا من دراسة العلاقات الانتيجينية بين الفيروسات والعزلات المختلفة وهذا يفيد في تقسيم الفيروسات
• يفيد في تقدير كمية البروتين النووي او البروتين
•  تعيين موقع الفيروس في انسجة النبات

طريقة الاليزا ELISA  
 
عبارة عن طريقة سيرولوجية حديثة وسريعة للكشف عن الفيروسات حتى قبل ظهورها وهي مهمة في البلدان التي تستورد التقاوي او مواد الاكثار وهي تعتمد على وجود kit كت يحوى كل المواد اللازمة لاجرائها

المواد اللازمة لاجراء العملية :

• الاجسام المضادة لفيروس معين و مصدره الارنب ويحفظ على درجة 4 درجة مئوية ويحوي مادة حافظة من ازيد الصوديوم بتركيز 0.05 %
• بفرات او منظمات
• و مادة التفاعل substrat او ال PNP وهي تخزن على 4 درجة مئوية
•  العينة المصابة او الفيروس المراد الكشف عنه
  عينة مصابة فعلا للمقارنة او ال POSSITIVE CONTROL ونحتاج لتنفيذها
  
• اطباق اليزا -جهاز لطحن العينة -مايكروبايبت - حضان - ثلاجة

وهي تجرى بطريقتين

1- الطريقة المباشرة DAS ELISA او DOUPLE ANTIBODY SANDWICH حيث يكون الفيروس او الانتيجن بين ساندوش من الاجسام المضادة

نغطي الطبق الخاص بهذه العملية والمكون من عدد من  العيون substrat حيث يوضع لكل عين100 ميكروليتر

• يتم التحضين داخل الحضان لمدة 4 ساعات في درجة حرارة 37 درجة مئوية او ليلة في الثلاجة
• نغسل الطبق باستخدام سائل الغسيل PBST
• نضع العينة المصابة بالفيروس بعد اعدادها بالطحن مع محلول الاستخلاص ثم تحضن طوال الليل او لمدة 16 ساعة في الثلاجة 4 درجة مئوية
•  تغسل الاطباق كما سبق لكن بالتكرار 3-4 مرات
• نضع 100 ميكروليتر من انتيبودي المرتبط مع انزبم الفوسفاتيز القلوي Alkaline phosphatase ثم يتم التحضين في الحضان لمدة ساعتين
• تغسل الاطباق 3-4 مرات مع ملاحظة خلو العيون من فقاقيع الهواء ويتم كما سبق قلب الطبق على الورق النشاف
• نضع مادة التفاعل الملونة المسماة PNP التي تعطي لون اصفر عند تفاعلها مع الانزيم حيث نضع لكل عين 100 ميكروليتر ويتم تحضيرها واستخدامها على السريع
• نترك الطبق في جو الغرفة لمدة ساعة بعيدا عن الضوء القوي او فى الحضان

تقييم النتيجة :
يتم الفحص بالعين كما سنفعل عندنا فاذا ظهر اللون الاصفر فهذا يعني وجود الاصابة واما اذا لم يظهر اللون فهذا يعني خلو العينة من الاصابة

واذا كان لدينا قارئ اليزا فاننا نقدر شدة التفاعل ويتم ذلك بقياس درجة امتصاص الضوء عند الموجة 405 نانوميتر