من الاختبارات الميكروبيولوجية

**********************

شرح مبسط للاختبارات المناعية

من حيث الأساس العلمي و التطبيق والتقييم.

أولا: الاختبارات المناعية الأولية

1) الإلايزا (ELISA):
عبارة عن مختصر لـ Enzyme linked immunosorbent assay
وفيه يتم استخدام أجسام مناعية موصومة (مرتبطة) "labeled" بإنزيم معين يمكن الكشف عنه بسهولة بشرط ألا يؤثر هذا الارتباط على نشاط أي من الأجسام المناعية أو الإنزيم. وهناك أنواع من الإنزيمات تستعمل لهذا الغرض منها: Alkaline phosphatase, HRPO (horseradish peroxidase)
ويمكن التعرف على الإنزيم باستعمال الركيزة (substrate) الخاصة به في وجود مادة تتلون عند أكسدتها.
ونظراً لسهولتها و أمانها فإن اختبارات الإلايزا تستعمل على نطاق واسع في المجال البيطري و هناك المئات من أطقم التشخيص التي تعتمد على الإلايزا لتشخيص أمراض الحيوان الفيروسية، البكتيرية، والطفيلية. ويمكن استعمال اختبارات الإلايزا في الكشف عن:
أنتيجين (مثل direct, capture or sandwich ELISA)
أو أجسام مناعية (مثل indirect or competitive ELISA)

ففي الإلايزا غير المباشرة، على سبيل المثال، يتم تثبيت أنتيجين معروف لميكروب معين في فتحات طبق بوليستيرين (يتم ذلك في وجود محلول كربونات/بيكربونات صوديوم عند pH 9.6 لمدة ساعة بالحضانة أو ليلة بالبراد). يتبع ذلك إضافة عينات الأمصال بتخفيف معين بالإضافة إلى عينات ضابطة ويترك الطبق لمدة 30 دقيقة ليتم التفاعل. بعد الغسيل يتم إضافة مضاد النوع المرتبط بالإنزيم (يشترى) بتخفيف معين ويترك الطبق لمدة 30 دقيقة. بعد الغسيل يتم إضافة الركيزة مع مادة قابلة للتلون ثم يترك الطبق لمدة 10-15 دقيقة في مكان مظلم بعدها يتم إيقاف التفاعل بتغيير الـ pH باستعمال حمض مخفف. يتم قراءة شدة اللون بالعين أو باستخدام جهاز قراءة طيفي (ELISA reader) حيث تكون هناك علاقة طردية بين كمية الأجسام المضادة بالعينة و شدة اللون.

أما في إلايزا الساندويتش فيتم تثبيت أجسام مضادة معروفة في فتحات الطبق ثم الكشف عن الأنتيجين الخاص بهذه الأجسام المضادة في العينة بإضافة العينات إلى الفتحات وتركها فترة للتفاعل. بعد الغسيل بمحلول فوسفات فسيولوجي يتم إضافة نفس نوع الأجسام المضادة ولكنه مرتبط بالإنزيم ويتبع ذلك غسيل ثم إضافة الركيزة و إكمال الاختبار كما هو الحال مع الإلايزا غير المباشرة.

هناك أنواع مختلفة من اختبارات الإلايزا تختلف أسماؤها باختلاف الطريقة ولكن في النهاية تتم القراءة بنفس الكيفية.

2) التألق المناعي (Immunofluorescence) = Fluorescence antibody technique "FAT"

كما هو الحال في الإلايزا فإنه في اختبار التألق المناعي يتم استخدام أجسام مضادة مرتبطة ولكن ليس بإنزيم وإنما بمادة تسمى fluorochrome و هي مواد كيميائية تمتص الأشعة فوق البنفسجية غير المرئية وتعيد بثها في التو في صورة ضوء مرئي يختلف لونه باختلاف المادة ومن أشهر المواد (FITC)Fluorescein isothiocyanate و Rhodamine isothiocyanate (RITC) حيث تنتج الأولى ضوء أخضر بينما تنتج الثانية ضوء أحمر عند وضعها في مسار أشعة فوق بنفسجية (المجهر المؤلق). وهناك نوعان من الاختبار
أ- Direct FAT (المباشر):

حيث تضاف أجسام مناعية لميكروب معين مرتبطة بمادة FITC على شريحة مثبتة قد تحتوي على الميكروب (مثل تشخيص السعار وفيه تكون الشريحة من دماغ حيوان نافق أو لعاب حيوان حي قد تحتوي على فيروس السعار). بعد فترة تحضين يتم الغسيل ثم فحص الشريحة بالمجهر المؤلق لرؤية بقع من اللون الأخضر التي تدل على وجود الأجسام المضادة المرتبطة بدورها بالفيروس الموجود بالعينة. أما في حالة السلبية فيظهر المجال مظلماً.

ب- Indirect FAT (غير المباشر):

تجرى للكشف عن وجود أجسام مضادة لميكروب معين بمصل حيوان مريض. وفيه يضاف المصل إلى شريحة محتوية على الميكروب و الذي تتحد معه أجسامه المضادة إن وجدت في العينة, وبعد فترة تحضين يتم الغسيل ثم إضافة أجسام مناعية مضادة للنوع مرتبطة بـمادة FITC وبعد التحضين يتم الغسيل ثم الفحص كما سبق باستخدام المجهر المؤلق.
عموماً فإن الاختبارات غير المباشرة أكثر حساسية عن المباشرة.

3) الاختبارات المناعية المعتمدة على النظائر المشعة (Radioimmunoassay "RIA"):
وفيها يتم ربط الأجسام المناعية أو الأنتيجين بأحد النظائر المشعة مثل اليود (125I). وهي ليست شائعة الاستعمال، لما فيها من خطورة، باستثناء قياس الهرمونات.

ثانيا: الاختبارات المناعية الثانوية

1) اختبارات التلازن (Agglutination tests)
التلازن المناعي يحدث عند الاتحاد والتشابك بين أجسام مناعية و أنتيجينات مجسمة (غير ذائبة) عن طريق محددات أنتيجينية سطحية. و من أنواع الأنتيجينات التي تناسب ذلك النوع من التفاعلات البكتيريا و الفطريات و الأوليات وكذلك كريات الدم الحمر. ومن أنواع اختبارات التلازن المناعي:

أ- التلازن الشريحي (السريع) Slide agglutination :

يتم بخلط نقطة من المصل مع نقطة من الأنتيجين على شريحة زجاجية أو بورسلين بيضاء يتبع ذلك تحريك الشريحة (rocking). يستدل على التفاعل الإيجابي بتكوين تجمعات من الأنتيجين على قاع الشريحة خلال 3 دقائق. ويمكن استعمال اختبار التلازن الشريحي لتصنيف معزولات بكتيرية لمعرفة ضربها المصلي (serotype) كما هو الحال مع السالمونيلا و E. coloi . و يستخدم أيضاً للاستدلال على وجود أجسام مضادة لميكروب معين في مصل الحيوان و من أشهر ذلك اختبار روزبنجال لتشخيص البروسيلا. و يفضل أن يكون الأنتيجين البكتيري ملوناً لتسهيل قراءة النتائج و لذلك فإن معظم أنتيجينات التلازن الشريحي تباع ملونة من قبل الشركات.

ب- التلازن البطئ (Slow agglutination):
هو اختبار كمي يجرى لمعايرة الأجسام المضادة لميكروب معين في العينات الإيجابية مع الاختبار السريع. وجرت العادة على إجرائه في أنابيب صغيرة (Wasserman) ولكن حديثا أصبح يجرى في أطباق ذات الفتحات المقعرة على نطاق كميات صغيرة توفيراً للجهد والوقت والمال. ويجرى بتخفيف عينات المصل ثنائيا في محلول ملح ثم إضافة أحجام مساوية من معلق ثابت من الأنتيجين البكتيري يتبع ذلك خلط ثم تحضين لمدة ليلة عند 37ºم. يعبر عن كمية الأجسام المضادة لكل عينة بكلمة titre وهي مقلوب أعلى تخفيف (أقل تركيز) من المصل الذي يستطيع أن يعطي تلازن واضح يظهر على شكل راسب تاركاً سائل سطحي رائق في الأنبوبة أو طبقة تشبه البطانية على قاع الفتحة في الطبق.

من المشاكل العملية التي قد تصادف من يقومون باختبارات التلازن الأنبوبي ظاهرة تسمى (prozone phenomenon) وهي ظهور أول أنابيب سلبية بينما التركيزات الأخف إيجابية وقد يعزى ذلك إلى عدم التشابك لزيادة كمية الأجسام المضادة في الأنابيب الأولى.

جـ - أنواع أخرى من التلازن المناعي:

التلازن غير المباشر (indirect or passive)

و هو تحميل أنتيجينات ذائبة (مثل polysaccharides) على سطح كريات دم حمراء أو مجسمات أخرى وبالتالي يكون دور المجسمات هو فقط إظهار التفاعل (يفيد في تشخيص الإصابة بالباستريلا ملتوسيدا).

اختبار حلقة الحليب لبانج (ABR)

يجرى للكشف عن إصابة الحيوانات الحلابة بالبروسيلا و يجرى على عينات حليب للكشف عن أجسام مناعية من النوع IgA الذي يميل للارتباط بكريات الدهن في الحليب و بالتالي يتم التفاعل بطبقة القشدة في عينات الحليب الخام الطازجة في الحالات الإيجابية. و فيه تضاف نقطة من أنتيجين البرويسلا الملون إلى 1 مللي حليب طازج غير مغلي و غير منزوع الدسم (يفضل وضعه في البراد ليلة). يتم الخلط بلطف ثم يوضع الخليط في حمام مائي عند 37 ºم. تلون حلقة الحليب مع عامود حليب أبيض يعتبر إيجابي (يجرى هذا الاختبار على تنك لأكثر من حيوان).

اختبار التلازن المجهري:

يجرى لتشخيص الإصابة باللبتوسبايرا وذلك بالكشف عن أجسامها المضادة بأمصال الحيوانات ويوظف لذلك المجهر ذات الساحة المظلمة (dark field) و مزرعة لبتوسبايرا حية.


ثانياً: اختبارات الترسيب المناعي (Immunoprecipitation):
على العكس من التلازن فإن الترسيب يحدث بين أنتيجينات ذائبة (غير مجسمة) و أجسامها المضادة وذلك بتكوين مركب غير ذائب عند التركيز الأمثل للتشابك و على حسب طريقة إجراء الاختبار فإن أشهر أنواع الترسيب المناعي هي:

أ- الترسيب الحلقي:
وفيه يتم إضافة مستخلص الأنتيجين المراد الكشف عنه بحرص على جدار أنبوبة صغيرة محتوية على أجسام مضادة نوعية مع عدم الخلط مثل اختبار أسكولي (Ascoli) لتشخيص الأنثراكس. تتكون حلقة بيضاء في مكان ما عند التقاء السائلين (equivalence zone).

ب- اختبارات الانتشار المناعي:
وفيها يتم استعمال وسط شبه صلب مثل الأجار ويسمح فيه بانتشار أحد شقي التفاعل أو كلاهما مثل:

- اختبار أوكترلوني Ouchterloney’s (اختبار الانتشار الثنائي):
حيث يوضع كل من الأنتيجين الذائب والمصل في فتحات متقابلة معمولة في أجار (~ 1%) في محلول ملح منظم ويسمح لكليهما بالانتشار نحو بعضهما وتكوين خط ترسيب في منطقة equivalence فيما بينهما. وبهذه الطريقة يمكن تعريف أحد شقي التفاعل بمعلومية الشق الآخر. وبهذا الاختبار أيضا يمكن التعرف على علاقة أنتيجينات (مثل معزولات لفيروس واح) مختلفة ببعضها وذلك بوضعها في فتحات متجاورة مقابل فتحة مركزية تحتوي على أجسام مضادة. عن طريق شكل خطي الترسيب يمكن معرفة العلاقة بين الفيروسات (متشابهة تماماً، متشابهة جزئياً أو ليست لها علاقة ببعضها). فمثلاً إذا تكون مايشبه المهماز (spur) فإن العلاقة هي تشابه جزئي وإذا تقاطع الخطان فإن العلاقة عدم تشابه وإذا اندمج الخطان فإنه تشابه كامل. وهذا الاختبار هو الأكثر شيوعاً وهو يناسب معظم الأمراض الفيروسية.

- اختبار مانسيني Mancini (ٍالانتشار الأحادي):
وفيه تخلط الأجسام المضادة مع الأجار ثم يترك ليجف و توضع عينة الأنتيجين الذائب في فتحات بالأجار حيث هي التي ستنتشر فقط على شكل دائرة لتقابل الأجسام المضادة بالأجار فتكون معها خط دائري على بعد معين يزيد كلما زاد تركيز الأنتيجين بالعينة. ويمكن قياس مستوى أنتيجين معين بمقارنته بضوابط لها تركيزات معلومة و ذلك بمعلومية نصف قطر الدائرة و لذلك فإنه يطلق على ذلك النوع من الاختبارات (Radial immunodiffusion). من Radius وهو نصف قطر الدائرة.

- اختبار أودين (Oudin):
وهو انتشار أحادي ولكن يوضع الأجار المحتوي على الأجسام المضادة في أنبوبة بدلا من طبق ليصبح الانتشار رأسياً بدلاً من أفقي.


ثالثاً: اختبار تثبيت المتمم (Complement fixation test “CFT):

ما هو المتمم؟ Complement
جهاز يتكون من 20 بروتين تقريباً وتوج مفردة في أمصال جميع الحيوانات ولكن بتركيز عال في خنازير غينيا. و بعضها يفقد نشاطه بالحرارة العالية نسبياً (56ºم) لمدة 30 دقيقة. وتتميز عناصر المتمم بأنها تنشط بالتفاعلات بين الأنتيجين وأجسامه المضادة لتتفاعل فيما بينها في سلسلة من التفاعلات تنتهي بتكوين مركب يؤدي تدمير جدار الخلايا المحتوية على الأنتيجين. وتم استغلال هذه الخصائص في تصميم اختبار عال الكفاءة يستخدم لتشخيص عديد من الأمراض الميكروبية يسمى اختبار تثبيت المتمم (CFT).

أساس الاختبار:
في هذا الاختبار يتم الاستناد على تفاعلين بين أنتيجينات وأجسامها المضادة أحدهما ثابت ويستخدم كريات الدم الحمراء الغنمية وأجسامها المضادة (amboceptor)، بالإضافة إلى التفاعل محل الاختبار ويتكون من أنتيجين ميكروب معروف وأمصال حيوانات يراد الكشف عن وجود أجسام مضادة بها لهذا الميكروب. أما المتمم فيمثله مصل خنازير غينيا. ويجرى الاختبار على مرحلتين بعد تقييم المتمم. يتم أولاً تسخين أمصال الحيوانات المراد اختبارها عند 56ºم (أكثر لحيوانات المناطق الحارة حتى 60ºم) لمدة نصف ساعة وذلك لتثبيط متممها (يستعيد المتمم نشاطه عند وضع العينات بالبراد ولذا ينبغي التثبيط عند إعادة الاختبار على نفس العينات). يتم إضافة أحجام ثابتة من الأنتيجين لعينات الأمصال المخففة ثنائياً في محلول فيرونال (Veronal). يتبع ذلك إضافة المتمم (مصل خنازير غينيا). بعد تحضين 30 دقيقة عند 37ºم أو ليلة في البراد يتم إضافة خليط من كريات حمر غنمية وأجسامها المضادة ثم يتبع ذلك تحضين 30 دقيقة عند 37ºم. تقرأ النتائج حيث يدل عدم تحطم الكريات الحمر على تثبيت المتمم مع التفاعل الأول نتيجة وجود أجسام مضادة للأنتيجين (نتيجة إيجابية) بينما تحطم الكريات الحمر يدل على عدم تثبيت المتمم بالتفاعل الأول لسلبيته وإنما ثبت مع التفاعل الثاني المكون من الكريات الحمر الغنمية وأجسامها المضادة فنشط وأدى إلى تدمير الأنتيجين وهو كرات الدم الحمر. يتم قراءة الاختبار كمياً بتسجيل أعلى تخفيف أدى إلى تثبيت المتمم وعدم تحطيم كريات الدم والتي تظهر في قاع فتحة الطبق على شكل أزرار تاركة المحلول السطحي رائق.

اختبارات مناعية أخرى

1- اختبارات التعادل (Neutralization tests)
تستفيد من مقدرة الأجسام المناعية النوعية من معادلة النشاط البيولوجي لسموم بكتيرية أو فيروسات معملياً. وعند إجرائها في حيوانات تجارب تسمى باختبارات الحماية. من أشهر اختبارات التعادل تفاعل ناجلر (Nagler reaction) والذي يستخدم لتشخيص التسمم المعوي بالبكتريا اللاهوائية Cl. perfringens باستعمال مضاد السم ألفا على منبت أجار صفار البيض. أما بالنسبة للفيروسات فإن الأجسام المناعية لفيروس معين تستطيع معادلته و منعه من إحداث أثره المرضي في طبقة خلايا أو بيض مخصب. ويستخدم ذلك للتعرف على فيروس معين في عينة أو أجسام مضادة لفيروس معين في مصل حيوان.

2- التراص الدموي ومنع التراص (Haemagglutination and Haemagglutinationinhibition “HA and HI")

التراص الدموي هي ظاهرة بيولوجية لبعض الفيروسات مثل الإنفلونزا لها القدرة على الارتباط بكرات الدم الحمر و تلازنها حولها. وتستطيع الأجسام المناعية الخاصة بتلك الفيروسات من منعها من قدرتها على إحداث التراص الدموي عندما تختلط بها و هي أشبه باختبارات التعادل ولكنها تعادل ظاهرة معينة وهي التراص الدموي.