الكشف عن الامراض الفيروسية باستخدام طريقة تهجين الاحماض النووية

اهمية استخدام المادة الوراثية

1-      صعوبة الحصول على الاجسام المضادة لبعض الفيروسات

2-      تستخدم فى الكشف عن الفيرويد

3-      صعوبة الكشف عن التركيزات المنخفضة باستخدام الطرق السيرولوجية

4-      استخدام المادة الوراثية فى التفرقة بين السلالات الفيروسية الت تتشابه فى الغلاف البروتينى

 نظرية استخدام تكنيك تهجين الاحماض النووية

عند حدوث تحلل او تفكك لشريط الحامض النووى المذدوج سواء عن طريق الحرارة او عن طريق المعاملة بقلوى وذلك تحت ظروف تحضين مناسبة يلى ذلك ارتباط هذه الضفائر المنفردة من الحامض النووى مع الشريط الاخر والذى سوف يكمل هذا الشريط المنفرد . وهذا الشريط المكمل يتم ترقيمة او تعليمة باحدى المواد غير المشعة عن طريق وضع مادة لونية معينة وبظهور هذا الون يدل على ان الشريط المنفرد الذى ارتبط مع الشريط المكمل هو من نفس نوع الفيروس الذى تم تحضير الحامض النووى المرقم.

الخطوات الرئيسية لاجراء هذا الاختبار

1.  يتم وضع العينات المراد اختبارها على غشاء من النيتروسليلوز او غشاء النايلون بطريقتين

أ‌.      طريقة Squash blot وهى عبارة عن هرس او طحن النسيج النباتى او الحشرى مباشرة على الغشاء

ب‌. طريقة Dot blot وفيها يتم طحن العينة المراد اختبارها فى محلول مناسب تم اجراء عملية الطرد المركزى ثم يضاف الراشح 2-5 ميكروليتر على الغشاء

طريقة Squash blot فى هذه الطريقة يتم نقل DNA (ناتج عملية PCR ) من على الجيل سواء كان اجاروزجيل او بولى اكلاميد جيل الى غشاء النايلون.

طريقة Northern blot ويتم نقل الحامض النووى RNA بعد عزلة تفريدة على الجيل الى غشاء النايلون.

2. غسيل وتثبيت الحامض الموجود على الغشاء باستخدام بعض المواد الكيماوية بهدف التخلص من البقايا النباتية وفى نفس الوقت يتم عمل فصل للحامض النووى والذى قد يتواجد تصورة مذدوجة الى اشرطة منفردة وذلك باستعمال محلول 0.5 عيارى من هيدروكلوريد الصديوم ومن اهم هذه المواد الكيماوية التى تستخدم فى الغسيل هو Tris  و2xssc  والايتانول .

بعد ذلك يعرض الغشاء لاشعة UV لمدة 3 دقائق لتثبيت الحامض النووى على الغشاء.

2.     تحضير البروب :

(شريط الحامض النووى المرقم والمعلم) يتم ترقيم الحامض النووى غالبا باستخدام مواد غير مشعة مثل مادة Digoxigenin  ويتم ذلك باستخدام طريقة PCR بعد عزل الحامض النووى الفيروسى واكثارة باستخدام طريقة PCR يؤخذ هذا الناتج بعد التاكد منه ويتم عمل اعادة PCR ولكن باستخدام قواعد نيوكلوتيدة مرقمة بدلا من القواعد العادية التى استخدمت فى المرة الاولى من التضاعف وبالتالى يتم اكثار DNA ولكن يكون الناتج معلم ومرقم بالمادة التى اضيفت فى مخلوط PCR .

طريقة اخرى لتحضير البروب وهى طريقة Randoum primer  مع اضافة القواعد النيوكليوتيدية المرقمة وتحت ظروف التحضين المناسبة يتم الحصول على البروب.

4. مرحلة ما قبل التهجين Prehybridization :

الغرض من هذه العملية هو عمل blocking للفلتر اى تغطية الاماكن غير الموجود بها العينات وهذه الخطوة تمم باستخدام محلول Prehybridization solution وذلك على 42 درجة مئووية لمدة 3 ساعات.

5. مرحلة التهجين Hybridization :

فى هذه المرحلة يتم اضافة البروب بعد تحويلة الى اشرطة منفردة باستخدام الحرارة 100 درجة مئووية لمدة 10دقائق . الى محلول Hybridization وذلك على 42 درجة مئووية ويترك طوال الليل .

6. مرحلة الغسيلWashing

تتم هذه المرحلة بهدف التخلص من البروب الذائد الذى لم يرتبط مع العينة الموجودة على الغشاء

7. مرحلة الكشف Detection  وهى تتم على خطوات

أ. اضافة Antididoxigenin  Antibody conjugate لتربط مع Probe doxigenin

ب. اضافة مادة التفاعل Substrate  على الغشاء حيث يعطى لون وهذا دليل على حدوث الارتباط مع العينة المراد اختبارها نع البروب

واهم المواد المستخدمة Nitro blue tetrazolum + 5- bromo 4- chloro  3- indoyl phosphate  حيث توضع هذه المواد على الغشاء لمدة تصل الى حوالى 4 ساعات او اكثر وذلك فى مكان مظلم عتى يظهر اللون الازرق بعد ذلك يتم الغسيل وذلك لتثبيت التفاعل.

د. عادل عبدالصبور رزق

د. محمود احمد عامر