استحثاث المقاومة  الجهازية في نبات زهرة الشمس ضد الفطر Macrophomina phaseolina  المسبب لمرض التعفن الفحمي بأستخدام فطر المايكورايزا Glomus sp وبعض انواع الفطر Trichoderma spp

المستخلص

   استعمل في هذه الدراسه فطر المايكورايزا Glomus sp وبعض انواع الفطر Trichoderma sppفي مكافحة مرض التعفن الفحمي على نبات زهرة الشمس المتسبب عن الفطر Macrophmina phaseolina حيث وجد ان انواع الفطرTrichoderma spp لها دورا تثبيطا للفطر Macrophmina phaseolina  حيث  تفوقت جميع عزلات الفطرTrichoderma spp  في قدرتها التضادية تجاه الفطر الممرض M. phaseolina بطريقة البقع حيث بلغت منطقة التثبيط 2.4 و2.6 و 2.5 و2.4 و 2.4سم للفطرياتT.a و T.h وT. r و T .t و T.v وعلى التوالي ، وبطريقة الزرع المزدوج حيث نلاحظ تفوق الفطر T.harizanum معنويا على باقي انواع الفطر Trichoderma spp  . وفي تجربة استخدام فطر المايكورايزا Glomus sp وبعض انواع Trichoderma spp في نمو وانبات زهره الشمس فقد تفوقت جميع المعاملات الفطريات الاحيائية في زياده نمو اطوال نباتات زهرة الشمس وكذلك حصلت زيادة في كمية الكلوروفيل في اوراق النبات قياسا بمعاملة المقارنة اما في ما يتعلق في تأثير الفطريات الاحيائية على نسبة انبات البذور فقد وجد عدم وجودفروقات معنوية بين المعاملات. وفي تجربة استخدام الفطر Glomus sp وبعض انواع الفطر Trichoderma sppفي السيطرة على الفطر الممرض    M. phaseolinaالمسبب لمرض التعفن الفحميفي نبات زهرة الشمس فقد وجد ان جميع الفطريات الاحيائية المستعملة  في خفض شدة الإصابة بالفطر M. phaseolina عند استعمالها في التربة  الملوثة بالفطر الممرض بثلاثة أيام إلا ان الفطر Glomus sp  و  T.hو  T.v كانوا الأكثر تأثيرا وبفارق معنوي عن بقية الفطريات .كما عملت هذه الفطريات على زيادة انزيمات البولي فينول اوكسديز والبيروسديز مقارنة بمعاملة المقارنة .

_________________________________________________________________________________________

المقدمة

    يعد محصول زهرة الشمس Helianthus annuus L.  المحصول الزيتي الثاني في العالم بعد فول الصويا Glycine max  L. وتصل نسبة الزيت في بذوره 47%  فضلاً عن أن زيته من افضل الزيوت النباتية الصحية الصالحة للتغذية البشرية لأرتفاع نسبة الاحماض الدهنية غير المشبعة Oleic وLinoleic والتي تتراوح نسبتها بين 85%-91% في حين لاتزيد نسبة الأحماض الدهنية المشبعة Palmitic وStearic عن 9%-12% (جدعان وآخرون ، 1999) أن تلك المميزات وغيرها جعلت هذا المحصول ذا أهمية حقلية كبيرة بدخوله في الأنتاج الزراعي والصناعي على نطاق واسع . 

    يصاب نبات زهرة الشمس بالعديد من المسببات المرضية ويعد مرض التعفن الفحمي المتسبب عن الفطر
 Goid Macrophomina phaseolina (Tassi) من أهم الأمراض والعوامل المحددة لزراعة هذا المحصول                 (Su وآخرون، 2001) حيث يسبب هذا المرض خسائر اقتصادية كبيرة لعدة محاصيل حقلية , و ينتشر مرض  التعفن الفحمي لزهرة الشمس في الكثير من مناطق زراعة هذا المحصول خاصة في المناطق التي تمتاز بقلة سقوط الامطار وارتفاع درجات الحرارة مع ملاحظة اعداد كثيرة من الاجسام الحجرية الصغيره في قشرة ولب الساق وتكون الاعراض اكثر وضوحا وقت التزهير (Jimenez - Diaz وآخرون ، 1983)

    يعد الفطر M .phaseolina من الفطريات المستوطنه في التربة ذات المدى العائلي الواسع والذي يصيب أكثر من 500 نوعاً نباتياً (Purkayastha  واخرون ،  2006) كما وجد إن الإصابة بهذا الفطر تزداد كلما تعرض النبات لعوامل الإجهاد البيئي كارتفاع درجة الحرارة وقلة الرطوبة (Almeida وآخرون، 2003) .

    استخدمت طرائق عدة في مكافحة مرض التعفن الفحمي مثل المكافحة الكيميائية (Ijaz واخرون ، 2012) الا ان بقاء الفطر بهيئة اجسام حجرية لمدة طويلة يجعل من مكافحته من الامور الصعبه . يعد استخدام الكائنات الحية الدقيقة في مجال المكافحة الاحيائية من الاتجهات البديلة الناجحة والمرغوب بها ومن اهم هذه الكائنات الفطر Trichoderma ، كما اشارت دراسات عدة ان فطريات المايكورايزا ومها الفطر Glomus sp  تعمل على تحفيز المقاومة الجهازية في النبات                              (Somssich  وHahlbrock ، 1998 ) كما تعمل ايضا على  زيادة جاهزية العناصر المعدنية ، و تثبيت النتروجين الجوي       ( Vessey ، 2003) كذلك لها دور حيوي في دورة العناصر الكبرى في الطبيعة ، كالكاربون ، النتروجين ، الفسفور ، الكبريت و البوتاسيوم . اذ تعمل على تحرير هذه العناصر من المركبات العضوية  و بذلك تسهم في التقليل من استخدام الأسمدة المعدنية بنسبة تتراوح بين 20-50 % ( Parharaj و اخرون ، 1999  و  Indiresh وآخرون ، 2003 ) ، وثبت أن لهذه الأحياء قابلية على أنتاج منظمات النمو و تثبيط نمو المسببات المرضية ( Davison  ، 1988 ) و زيادة تحمل النبات لظروف الاجهاد البيئي          ( Brundrett ،1991)  ونظراً لأهمية هذا الموضوع وعدم وجود دراسات تفصيلية حوله في العراق ، فقد هدفت الدراسة إلى :

1- تقييم فاعلية فطر المايكورايزا Glomus sp  في خفض اصابة نبات زهرة الشمس بالفطر M. phaseolina

2- دراسة تقييم كفاءة انواع مختلفة من الفطر Trichoderma sp في نمو الفطر M. phaseolina مختبريا

3– قدرة فطر المايكورايزا Glomus sp  وبعض انواع الفطر   Trichoderma sppفي تحفيز المقاومة الجهازية في نبات                                                                                                      زهرة الشمس عن طريق زيادة انزيمات البولي فينول اوكسديز والبيروكسديز .

المواد وطرائق العمل

 عزل وتشخيص الفطر Macrophmina phaseolina

    جلبت عدد من نباتات زهرة الشمس المزروعة في بعض الحقول في محافظة القادسية والظاهرة عليها أعراض الإصابة بمرض التعفن الفحمي بشكل واضح (جفاف النبات وتلون قاعدة الساق بلون بني داكن مع تقشر قاعدة الساق ووجود الأجسام الحجرية السوداء وانتشارها في قشرة ولب النبات) الى المختبر. غسلت قواعد سيقان النباتات والمجموع الجذري بماء الحنفية للتخلص من الأتربة والعوالق الأخرى ثم قطعت الى قطع صغيرة بطول (0.5-1سم) ثم عقمت بمحلول هايبوكلورات الصوديوم (NaOCl) بتركيز 10% من المستحضر التجاري لمدة (3-5) دقائق ثم غسلت بماء مقطر معقم. ثم جففت على ورق ترشيح بعدها زرعت بواقع خمس قطع نباتية في كل طبق بتري حاوي على وسط غذائي M.E.A معقم (Malt Extract Agar) مضاف له مضاد حياتي Chloroamphenicol بتركيز (250 ملغم/لتر) ثم وضعت الأطباق في الحاضنة في درجة حرارة 27 ± 2مْ لمدة خمسة أيام. تم تنقية عزلات الفطر وذلك بنقل أجزاء من طرف الخيط الفطري لمستعمرة الفطر الممرض بواسطة إبرة معقمة الى أطباق بتري حاوية على الوسط الغذائي M.E.A  المعقم وحضنت الأطباق في الحاضنة في درجة حرارة 28 ± 2مْ لمدة ثلاثة أيام.  شخص الفطر اعتماداً على الصفات التصنيفية المذكورة في (Sinclair ، 1982) واعطيت هذه العزلة الرقم (2) اما العزلة رقم (1) فكان مصدرها مختبرات كلية الزراعة – جامعة البصرة . تم تنشيط العزلات وزراعتها وسط غذائي صلب مائل (Slant) وحفظها في الثلاجة على درجة حرارة 4 مْ للدراسات والتجارب اللاحقة.

عزل انواع الفطر الاحيائي Trichoderma sp

  أخذت عينات عشوائية من ترب حقول مزروعة بنبات زهره الشمس محافظة القادسية واخرى من ترب البيوت البلاستيكية في صفوان محافظة البصره المزروعة بنباتي الطماطة والخيار المتميزه بالنمو عن النباتات الاخرى من منطقة الجذور Rhizosphere بعد خلط العينات كلا على حده تركت في المختبر لتجف لمدة 24 ساعة ونخلت في منخل سعة فتحاته 2 ملم حضرت سلسلة تخافيف من عينات التربة (3 - 6). نقل 1 مل من كل تخفيف الى أطباق بتري معقمة قطر 9 سم و أضيف لها الوسط الغذائي P.D.A المعقم والمضاف إليه المضاد الحياتي Chloroamphenicol بتركيز 250 ملغم/لتر وبثلاث مكررات لكل تخفيف ولكل تربة. حركت الأطباق حركة رحوية لضمان توزيع وتجانس العينة الترابية مع الوسط الغذائي حضنت الأطباق في الحاضنة على درجة حرارة 25ْم لمدة 3 أيام. بعد الحضن

    شخصت عزلات الفطر اعتمادا على الصفات المزرعية والمظهرية وبأتباع المفاتيح التصنيفية فيRifai  (1969). ونميت على وسط غذائي صلب مائل (Slant) وحفظت في الثلاجة على درجة حرارة 4 مْ للدراسات والتجارب اللاحقة. وجرى الحصول على عزلات اخرى لمقارنة النتائج حيث كان مصدر عزلتان من الفطر T.haizanum منها مختبر المقاومة الحيوية / قسم وقاية النبات / كلية الزراعة جامعة الكوفة و منها عزلة التحدي (مبيد التحدي ) ، اما عزلة الفطر T. veride فكان مصدرها مختبرات كلية الزراعة - جامعة البصرة.

اختبار القدرة الامراضية للفطر Macrophmina phaseolina

    استعملت في هذه التجربة أصص بلاستيكية حجم 5 كغم ذات قطر 13سم وعمق 14سم تحتوي على مزيج من التربة والبتموس بنسبة 1:2 عقم مزيج التربة باستعمال الفورمالين التجاري وذلك بتحضير محلول مكون من 50:1 فورمالين / ماء أستعمل المحلول بنسبة 3 لتر ماء / م 3 تربة ( طواجن ، 1975 ) . بعد ذلك لقحت الاصص بعزلتي الفطر Macrophmina phaseolina عزلة رقم ( 1 ) وعزلة رقم (2 ) المحمل على بذور الدخن  بنسبة 0.5% وزن/وزن  وكلا على انفراد اما معاملة المقارنة فتضمنت اضافة بذور الخن المعقم فقط , بعد ثلاثة ايام زرعت الاصص ببذور عباد الشمس صنف Panam وبواقع 10 بذور لكل اصيص ثم سقيت بأحتراس وكلما دعت الحاجة . بعد ثلاثة اسابيع  من الزراعة حسبت نسبة انبات البذور وعدد البادرات الميتة وبعد ستة اسابيع حسبت شدة الإصابة وفق مقياس مكون من خمس درجات كالأتي:

ثم استخرجت شدة الإصابة حسب معادلةMickenny  (1923) 

                       مجموع عدد النباتات من الدرجة 0 × 0 + ..... + مجموع عدد النباتات من الدرجة 4 × 4

% لشدة الاصابة =     ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ  

                                  العدد الكلي للنباتات المفحوصة × أعلى درجة

اختبار الكفاءة التضادية للفطر Trichoderma.spp ضد الفطر الممرض M.phaseolina

اولا طريقة البقع Spotting

اعتمدت طريقة Aghighi وآخرون (2004) في اختبار الكفاءة التضادية للانواع الفطر Trichoderma.spp ضد الفطر الممرض M.phaseolina حيث قسم طبق بتري قطر 8.5سم حاو على وسط غذائي P.D.A معقم الى أربعة أقسام متساوية ولقح مركز الطبق بقرص 0.5 سم من مستعمرة الفطر الممرض M.phaseolina بعمر 72 ساعة. تم اخذ اللقاح بواسطة ثاقب فلين معقم ولقح كل قسم من الأقسام الأربعة وعلى مسافة 3سم من مركز الطبق بقرص 0.5 سم من كل عزلة من عزلات الفطر التضادي T.a و T.h و T.r و T.t و T.v  اما معاملة المقارنة تضمنت تلقيح مركز الطبق بقرص مماثل من مستعمرة الفطر الممرض M.phaseolina فقط. نفذت التجربة بثلاثة مكررات لكل معاملة وحضنت الأطباق في الحاضنة عند درجة حرارة 25 ± 1مْ لمدة 4أيام. تم تحديد القدرة التضادية للفطر الاحيائي تجاه الفطر الممرض عند وصول نمو الفطر الممرض في معاملة المقارنة الى حافة الطبق وذلك بطرح مسافة نمو الفطر الممرض من جهة التضاد المباشر مع الفطر الاحيائي من المسافة الكلية بين الفطرين (3 سم) وفق المعادلة التالية:

C=A – B

حيث ان:-

A = المسافة الكلية بين الفطرين (3 سم).

B = مسافة نمو الفطر الممرض M.phaseolina من جهة التضاد المباشر.

C = المسافة المتبقية (منطقة التثبيط).

صنفت القدرة التضادية الى عدة فئات  هي:

<!--يعد الفطر الاحيائي ذا قدرة تضادية عالية للفطر الممرض إذا كانت قيمه C ≥ 2 سم ويرمز له (+++).

<!--يعد الفطر الاحيائي ذا قدرة تضادية متوسطة للفطر الممرض إذا كانت C من 1- 1.9 سم ويرمز له بالرمز (++).

<!--يعد الفطر الاحيائي ذا قدرة تضادية ضعيفة للفطر الممرض إذا كانت قيمة C ≤ 0.9 سم ويرمز له بالرمز (+).

        واختيرت العزلة الأكثر تثبيطاً للدراسات اللاحقة.

ثانياً: طريقة الزرع المزدوج   

   استعملت تقنية الزرع المزدوج Double culture technique في أطباق بتري قطر 9 سم حاوية على الوسط الغذائي .P.D.A المعقم , ولاختبار ألقدره التضادية للفطريات المستخدمة في الدراسة حيث لقحت حافة مركز نصف  طبق  بقرص  قطره  0.5 سم من حافة النمو القطري لمستعمرة الفطر M.paseolina و ولقحت حافة النصف الأخر بقرص مماثل  لانواع فطر المقاومة الحيوية Tichodema.spp النامية على الوسط الغذائي P.D.A. وبعمر 5  أيام وهي T.a و T.h و T.r و T.t و T.v كررت كل معاملة ثلاث مرات كما نفذت معاملة السيطرة وذلك بتلقيح مركز القسم الأول من الطبق بالفطرالممرض المذكور أعلاه وفطر المقاومة الحيوية فقط وكل على انفراد  . وحضنت الأطباق جميعها في الحاضنة بدرجة حرارة  2±28 مْ   لمدة4 أيام , ثم جرى قياس معدل النمو القطري لكل من للفطرين الممرضين وفطر المقاومة الحيوية باستخدام مسطرة شفافة. و تم تقدير درجة التضاد لكل فطر حسب المقياس الذي ذكره Bell وآخرون ( 1982) وكما يأتي