المقدمة
يعد محصول زهرة الشمس Helianthus annuus L. المحصول الزيتي الثاني في العالم بعد فول الصويا Glycine max L. وتصل نسبة الزيت في بذوره 47% فضلاً عن أن زيته من افضل الزيوت النباتية الصحية الصالحة للتغذية البشرية لأرتفاع نسبة الاحماض الدهنية غير المشبعة Oleic وLinoleic والتي تتراوح نسبتها بين 85%- 91% في حين لاتزيد نسبة الأحماض الدهنية المشبعة Palmitic وStearic عن 9%- 12% (1) أن تلك المميزات وغيرها جعلت هذا المحصول ذا أهمية حقلية كبيرة بدخوله في الأنتاج الزراعي والصناعي على نطاق واسع . يصاب نبات زهرة الشمس بالعديد من المسببات المرضية ويعد مرض التعفن الفحمي Charcoal rot المتسبب عن الفطر
Goid Macrophomina phaseolina (Tassi) من أهم الأمراض والعوامل المحددة لزراعة هذا المحصول (33) حيث يسبب هذا المرض خسائر اقتصادية كبيرة لعدة محاصيل حقلية , و ينتشر مرض التعفن الفحمي لزهرة الشمس في الكثير من مناطق زراعة هذا المحصول خاصة في المناطق التي تمتاز بقلة سقوط الامطار وارتفاع درجات الحرارة مع ملاحظة اعداد كثيرة من الاجسام الحجرية الصغيره في قشرة ولب الساق وتكون الاعراض اكثر وضوحا وقت التزهير (20) . يعد الفطر M .phaseolina من الفطريات المستوطنه في التربة ذات المدى العائلي الواسع والذي يصيب أكثر من 500 نوعاً نباتياً (26) كما وجد إن الإصابة بهذا الفطر تزداد كلما تعرض النبات لعوامل الإجهاد البيئي كارتفاع درجة الحرارة وقلة الرطوبة (6)
استخدمت طرائق عدة في مكافحة مرض التعفن الفحمي مثل المكافحة الكيميائية (Ijaz واخرون ، 2012) الا ان بقاء الفطر بهيئة اجسام حجرية لمدة طويلة يجعل من مكافحته الامور الصعبه . يعد استخدام الكائنات الحية الدقيقة في مجال المكافحة الاحيائية من الاتجهات البديلة الناجحة والمرغوب بها ومن اهم هذه الكائنات الفطر Trichoderma ، كما اشارت دراسات عدة ان فطريات المايكورايزا ومنها الفطر Glomus sp تعمل على تحفيز المقاومة الجهازية في النبات (33 ) كما تعمل ايضا على زيادة جاهزية العناصر المعدنية ، و تثبيت النتروجين الجوي ( 35) كذلك لها دور حيوي في دورة العناصر الكبرى في الطبيعة ، كالكاربون ، النتروجين ، الفسفور ، الكبريت و البوتاسيوم . اذ تعمل على تحرير هذه العناصر من المركبات العضوية و بذلك تسهم في التقليل من استخدام الأسمدة المعدنية بنسبة تتراوح بين 20-50 % ( 25 ) و ( 19 ) ، وثبت أن لهذه الأحياء قابلية على أنتاج منظمات النمو و تثبيط نمو المسببات المرضية ( 11 ) و زيادة تحمل النبات لظروف الاجهاد البيئي( 9) ونظراً لأهمية هذا الموضوع وعدم وجود دراسات تفصيلية حوله في العراق ، فقد هدفت الدراسة إلى :
1- تقييم فاعلية فطر المايكورايزا Glomus sp في خفض اصابة نبات زهرة الشمس بالفطر M. phaseolina
2- دراسة تقييم كفاءة انواع مختلفة من الفطر Trichoderma sp في نمو الفطر M. phaseolina مختبريا
3– تقييم كفاءة عناصر المكافحة الاحيائية في مكافحة مرض التعفن الفحمي حقليا.
المواد وطرائق العمل
عزل وتشخيص الفطر Macrophmina phaseolina
جلبت عدد من نباتات زهرة الشمس المزروعة في بعض الحقول في محافظة القادسية والظاهرة عليها أعراض الإصابة بمرض التعفن الفحمي بشكل واضح (جفاف النبات وتلون قاعدة الساق بلون بني داكن مع تقشر قاعدة الساق ووجود الأجسام الحجرية السوداء وانتشارها في قشرة ولب النبات) الى المختبر. غسلت قواعد سيقان النباتات والمجموع الجذري بماء الحنفية للتخلص من الأتربة والعوالق الأخرى ثم قطعت الى قطع صغيرة بطول (0.5-1سم) ثم عقمت بمحلول هايبوكلورات الصوديوم (NaOCl) بتركيز 10% من المستحضر التجاري لمدة (3-5) دقائق ثم غسلت بماء مقطر معقم. ثم جففت على ورق ترشيح بعدها زرعت بواقع خمس قطع نباتية في كل طبق بتري حاوي على وسط غذائي P.D.A معقم (Potato Dextrose Agar) مضاف له مضاد حياتي Chloroamphenicol بتركيز (250 ملغم/لتر) ثم وضعت الأطباق في الحاضنة في درجة حرارة 27 ± 2مْ لمدة خمسة أيام. تم تنقية عزلات الفطر وذلك بنقل أجزاء من طرف الخيط الفطري لمستعمرة الفطر الممرض بواسطة إبرة معقمة الى أطباق بتري حاوية على الوسط الغذائي P.D.A المعقم وحضنت الأطباق في الحاضنة في درجة حرارة 28 ± 2مْ لمدة ثلاثة أيام. شخص الفطر اعتماداً على الصفات التصنيفية المذكورة في (30) واعطيت هذه العزلة الرقم (2) اما العزلة رقم (1) فكان مصدرها مختبرات كلية الزراعة – جامعة البصرة . تم تنشيط العزلات وزراعتها وسط غذائي صلب مائل (Slant) وحفظها في الثلاجة على درجة حرارة 4 مْ للدراسات والتجارب اللاحقة.
عزل انواع الفطر الاحيائي Trichoderma sp
أخذت عينات عشوائية من ترب حقول مزروعة بنبات زهره الشمس محافظة القادسية في شهر ايار لسنة 2012 كما اخذت تربة من البيوت البلاستيكية في صفوان محافظة البصره في شهر شباط لسنة 2012 المزروعة بنباتي الطماطة والخيار المتميزه بالنمو عن النباتات الاخرى من منطقة الجذور Rhizosphere بعد خلط العينات كلا على حده و تركت في المختبر لتجف لمدة 24 ساعة ونخلت في منخل سعة فتحاته 2 ملم حضرت سلسلة تخافيف من عينات التربة (3 - 6). نقل 1 مل من كل تخفيف الى أطباق بتري معقمة قطر 9 سم و أضيف لها الوسط الغذائي P.D.A المعقم والمضاف إليه المضاد الحياتي Chloroamphenicol بتركيز 250 ملغم/لتر وبثلاث مكررات لكل تخفيف ولكل تربة. حركت الأطباق حركة رحوية لضمان توزيع وتجانس العينة الترابية مع الوسط الغذائي حضنت الأطباق في الحاضنة على درجة حرارة 25ْم لمدة 3 أيام. بعد الحضن شخصت عزلات الفطر اعتمادا على الصفات المزرعية والمظهرية وباتباع المفاتيح التصنيفية المعتمده في ( 14) ونميت على وسط غذائي صلب مائل (Slant) وحفظت في الثلاجة على درجة حرارة 4 مْ للدراسات والتجارب اللاحقة. جرى الحصول على عزلات اخرى لمقارنة النتائج حيث كان مصدر عزلتان من الفطر T.haizanum منها مختبر المقاومة الاحيائية / قسم وقاية النبات / كلية الزراعة جامعة الكوفة و منها عزلة التحدي (مبيد التحدي ) ، اما عزلة الفطر T. viride فكان مصدرها مختبرات كلية الزراعة - جامعة البصرة.
اختبار القدرة الامراضية للفطر Macrophmina phaseolina
استعملت في هذه التجربة أصص بلاستيكية سعة 5 كغم ذات قطر 13سم وعمق 14سم تحتوي على مزيج من التربة والبتموس بنسبة 1:2 عقم مزيج التربة باستعمال الفورمالين التجاري وذلك بتحضير محلول مكون من 50:1 فورمالين / ماء أستعمل المحلول بنسبة 3 لتر ماء / م 3 تربة ( 2 ) . بعد ذلك لقحت الاصص بعزلتي الفطر Macrophmina phaseolina عزلة رقم ( 1 ) وعزلة رقم (2 ) المحمل على بذور الدخن بنسبة 0.5% وزن/وزن وكلا على انفراد اما معاملة المقارنة فتضمنت اضافة بذور الخن المعقم فقط , بعد ثلاثة ايام زرعت الاصص ببذور زهرة الشمس صنف Panam وبواقع 10 بذور لكل اصيص ثم سقيت بأحتراس وكلما دعت الحاجة . بعد ثلاثة اسابيع من الزراعة حسبت نسبة انبات البذور وعدد البادرات الميتة وبعد ستة اسابيع حسبت شدة الإصابة وفق مقياس مكون من خمس درجات كالأتي:
|
الدرجة |
الوصف |
|
0 |
النبات سليم |
|
1 |
1-25 من الأوراق صفراء |
|
2 |
26-50 من الأوراق صفراء مع تلون بني بسيط في قاعدة الساق |
|
3 |
51-75 الأوراق صفراء مع تلون قاعة الساق بلون بني |
|
4 |
76-100 الأوراق يابسة والنبات ميت بالكامل مع تقشر قاعدة الساق |
ثم استخرجت شدة الإصابة حسب معادلة (23)
مجموع عدد النباتات من الدرجة 0 × 0 + ..... + مجموع عدد النباتات من الدرجة 4 × 4
% لشدة الاصابة = ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ
العدد الكلي للنباتات المفحوصة × أعلى درجة
اختبار الكفاءة التضادية للفطر Trichoderma.spp ضد الفطر الممرض M.phaseolina
اولا طريقة البقع Spotting
اعتمدت طريقة (3) في اختبار الكفاءة التضادية للانواع الفطر Trichoderma.spp ضد الفطر الممرض M.phaseolina حيث قسم صحن بتري قطر 8.5سم حاو على وسط غذائي P.D.A معقم الى أربعة أقسام متساوية ولقح مركز الطبق بقرص 0.5 سم من مستعمرة الفطر الممرض M.phaseolina بعمر 72 ساعة. تم اخذ اللقاح بواسطة ثاقب فلين معقم ولقح كل قسم من الأقسام الأربعة وعلى مسافة 3سم من مركز الطبق بقرص 0.5 سم من كل عزلة من عزلات الفطر التضادي T.humatum و T.harizanum و T.konngi و T.harizanum( عزلة مبيد التحدي ) و T.viride والذي يرمز لهم T.a و T.h و T.r و T.t و T.v على التوالي ، اما معاملة المقارنة تضمنت تلقيح مركز الطبق بقرص مماثل من مستعمرة الفطر الممرض M.phaseolina فقط. نفذت التجربة بثلاثة مكررات لكل معاملة وحضنت الأطباق في الحاضنة عند درجة حرارة 25 ± 1مْ لمدة 4أيام. تم تحديد القدرة التضادية للفطر الاحيائي تجاه الفطر الممرض عند وصول نمو الفطر الممرض في معاملة المقارنة الى حافة الطبق وذلك بطرح مسافة نمو الفطر الممرض من جهة التضاد المباشر مع الفطر الاحيائي من المسافة الكلية بين الفطرين (3 سم) وفق المعادلة التالية:
C=A – B
حيث ان:-
A = المسافة الكلية بين الفطرين (3 سم).
B = مسافة نمو الفطر الممرض M.phaseolina من جهة التضاد المباشر.
C = المسافة المتبقية (منطقة التثبيط).
صنفت القدرة التضادية الى عدة فئات هي:
1- يعد الفطر الاحيائي ذا قدرة تضادية عالية للفطر الممرض إذا كانت قيمه C ≥ 2 سم ويرمز له (+++).
2- يعد الفطر الاحيائي ذا قدرة تضادية متوسطة للفطر الممرض إذا كانت C من 1- 1.9 سم ويرمز له بالرمز (++).
3- يعد الفطر الاحيائي ذا قدرة تضادية ضعيفة للفطر الممرض إذا كانت قيمة C ≤ 0.9 سم ويرمز له بالرمز (+).
واختيرت العزلة الأكثر تثبيطاً للدراسات اللاحقة.
ثانياً: طريقة الزرع المزدوج
استعملت تقنية الزرع المزدوج Double culture technique في أطباق بتري قطر 9 سم حاوية على الوسط الغذائي .P.D.A المعقم , ولاختبار ألقدره التضادية للفطريات المستخدمة في الدراسة حيث لقحت حافة مركز نصف طبق بقرص قطره 0.5 سم من حافة النمو القطري لمستعمرة الفطر M.paseolina و ولقحت حافة النصف الأخر بقرص مماثل لانواع فطر المقاومة الحيوية Tichodema.spp النامية على الوسط الغذائي P.D.A. وبعمر 5 أيام وهي T.a و T.h و T.r و T.t و T.v كررت كل معاملة ثلاث مرات كما نفذت معاملة السيطرة وذلك بتلقيح مركز القسم الأول من الطبق بالفطرالممرض المذكور أعلاه وفطر المقاومة الحيوية فقط وكل على انفراد . وحضنت الأطباق جميعها في الحاضنة بدرجة حرارة 28± 2مْ لمدة4 أيام , ثم جرى قياس معدل النمو القطري لكل من الفطرين الممرضين وفطر المقاومة الاحيائية باستخدام مسطرة شفافة. و تم تقدير درجة التضاد لكل فطر حسب المقياس الذي ذكرها ( 8) وكما يأتي
|
الدرجة |
النمو ( فطر المقاومة الاحيائية ) |
|
1 |
الفطر المضاد يغطي الطبق بكاملة |
|
2 |
الفطر المضاد يغطي ثلثي مساحة الطبق |
|
3 |
الفطر المضاد والفطر الممرض كل منهما يغطي نصف مساحة الطبق |
|
4 |
الفطر الممرض يغطي ثلثي مساحة الطبق |
|
5 |
الفطر الممرض يغطي الطبق بالكامل |
دراسة تأثير راشح مزرعة انواع الفطر T.harzianum في نمو الفطر M.phaseolina
حضر الوسط الغذائي السائل Potato Dextrose المكون من مستخلص 200غم بطاطا و 20غم Dextrose/لتر ماء مقطر وزع في دوارق مخروطية سعة 250مل وبمعدل 200مل/دورق. عقم الوسط الغذائي بجهاز التعقيم البخاري على درجة حرارة 121مْ وضغط 15 باوند/انج2 لمدة 20 دقيقة.بردت الدوارق ولقح كل منها بقرص قطر 0.5 سم من الوسط الغذائي P.D.A المنمى عليه الفطريات T.hوT.A وT.v وT.T وT.R بعمر خمسة أيام كل على انفراد ثم حضنت الدوارق عند درجة حرارة 28 ± 2 لمدة 14 أيام مع مراعاة رج محتويات الدوارق كل 2-3 يوم رشحت مزرعة الفطر السابقة خلال ورق ترشيح نوع whatman filter paper No.1) ثم أعيد الترشيح باستعمال فلتر ملي بور حجم 0.22 ملي مايكرون وذلك لضمان فصل ابواغ الفطر عن الراشح الفطري بمساعدة جهاز التفريغ الهوائي (Vaccum).
حضرت بعدها سلسلة تراكيز من راشح كل عزله من الفطريات الاحيائية 10، 20، و30 % أضيفت الى الوسط الغذائي P.D.A المعقم مع مراعاة تعديل نسبة الاكار قبل تعقيم الوسط. صبت الأوساط الغذائية الحاوية على الرواشح في أطباق بتري معقمة قطر 9 سم ثم لقحت الأوساط بعد تصلبها بأقراص قطر كل منها 0.5 سم من الوسط الغذائي المنمى عليه الفطر الممرض M. phaseolina بعمر 72 ساعة في مركز كل طبق . كررت المعاملات بثلاثة مكررات لكل منها ثم حضنت الأطباق في الحاضنة في درجة حرارة 28 ± 2ْم لمدة أسبوع .ثم قيس معدل النمو القطري بأخذ معدل قطرين متعامدين يمران بمركز الطبق بعد وصول نمو الفطر في معاملة المقارنة الى حافة الطبق.
التعرف على المركبات الموجوده في راشح الفطر T.harzanum بتقنية GC MS
وزع الوسط الغذائي PD في دوارق زجاجية مخروطية حجم (250 مل ) بمعدل (200 مل ) لكل دورق عقم الوسط الغذائي بجهاز التعقيم البخاري ثم لقحت الدوارق بقرص حجم 0.5 سم من الوسط لغذائي النامي علية الفطر T.harizanum بعمر اربعة ايام حضنت الدوارق على درجة حرارة 25م لمدة 14 يوم أخذين بنظر الاعتبار تحريك ورج الدوارق الزجاجية كل يومين ثم بعد ذلك رشحت الرواشح بأستخدام ورق ترشيح Watman-No1 وبعدها رشحت بمرشح دقيق 0.2 (فلترملي بور ) ثم جفتت بجهاز التجفيت freeze dryer واستخلصت العينات بأستخدام الايثانول 10% بعدها اخذ 0.2 مل من المستخلص وحقن بجهازGCMS- نوع Shimadzu
تأثير الفطرالمايكورايزا G.mosseae. وانواع الفطرTrichoderma sp في اصابة نبات زهرة الشمس بالفطر M.phaseolina
استعمل في هذه التجربة مزيج من التربة والبتموس وبنسبة 1:2ومعقمة بالفورمالين التجاري كما في الفقرة السابقة وضعت التربة في اصص بلاستيكية لوثت تربة الاصص بالفطر M.phaseolina بمعدل 0.5% وزن / وزن بعد ذلك رطبت بالماء ثم بعد ثلاثة ايام اظيف لقاح الفطريات الاحيائيه T.a و T.h و T.r و T.t و T.v المحملة على بذورالدخن وبنسبة 5., % وزن / وزن الى تربة الاصص ثم رطبت الاصص وبعد ثلاثة ايام زرعت ببذور عباد الشمس وبمعدل 10 بذور لكل اصيص ، ثم اظيف لقاح فطر المايكورايزا G.mosseae. المتكون من ( لقاح الفطر + جذورمصابة + تربة جافة) الى الاصص ومعدل 20 غم لكل اصيص ثم زرعت ببذورزهرة الشمس صنف Panam وبواقع 10 بذور لكل اصيص وسقيت بالماء كلما دعت الحاجة وبعد اسبوعين من الانبات حسبت النسبة المئوية للانبات ونسبة موت البادرات وبعد سبعة اسابيع حسبت نسبة الاصابة وشدة الاصابة بالفطر M.phaseolina وحسبت نسبة اصابة الجذور بالفطر المايكورايزا بالنسبة للنباتات المعاملة به
حللت نتائج الدراسة بإستخدم التصميم تام التعشية CRD وإختبار أقل فرق معنوي LSD على مستوى 0.5% لمقارنة النتائج واستعمل البرنامج الاحصائيGenstat في تحليل البيانات.
النتائج والمناقشة
عزل الفطر الممرض واختبار قدرته المرضية
تم الحصول على عزلة الفطر M.phaseolina من نباتات زهرة الشمس ظاهرة عليها أعراض الإصابة بمرض التعفن الفحمي بشكل واضح . اضافة الى العزلة المأخوذة من مختبرات كلية الزراعة وأظهرت نتائج اختبار القدرة الامراضية إن العزلة (1) كانت أكثر اختزالاً للنسبة المئوية لإنبات البذور إذ بلغت هذه النسبة 70.56% مقارنة بـ 67.75% للعزلة رقم (2) في حين بلغت النسبة المئوية لإنبات البذور في معاملة المقارنة 86.66%. أظهرت النتائج وجود اختلافات معنوية بين معاملة المقارنة والعزلتين 1 و 2 في النسبة المئوية لموت البادرات بعد الإنبات إلا إن الفروقات لم تكن معنوية بين عزلتي الفطر 1 و 2 اذ بلغت النسبة المئوية لموت البادرات 0 و 40 و 30% على التوالي, اما شدة الاصابة فقد تفوقت العزلة ( 1 ) معنويا على العزلة 2 حيث بلغت شدة الاصابة 75,3 % بينما العزلة 2 بلغت 60. 63% وتتفق هذه النتائج مع دراسات سابقة والتي اشير فيها الى اختلاف القدرة الامراضية لعزلات الفطر فقد ذكر (28 ) ان عزلات الفطر M.phaseolina المعزولة من نبات زهرة الشمس من مناطق مختلفة في ايران اختلفت في قابليتها الامراضية وان اختلاف القدرة الامراضية للفطر M.phaseolina في إصابة زهرة الشمس بمرض التعفن الفحمي قد اعزي الى حدوث الطفرات (28).
جدول ( 1 ) اختبار الامراضية لعزلتي الفطر M.phaseolina على نبات زهرة الشمس
|
عزلات الفطر |
% لانبات بذورزهرة الشمس |
% لموت بادرات زهرة الشمس |
% شدة اصابة زهرة الشمس الفطر M.phaseolina |
|
العزلة (1 ) |
70.56 |
40 |
75,3 |
|
العزلة (2 ) |
67.75 |
30 |
63.6 |
|
المقارنة ( بذور دخن معقم فقط ) |
86.66 |
0 |
0 |
|
0.05 L.S.D |
1,334 |
11.32 |
6,07 |
عزل الفطر الاحيائي Trichoderma spp
تم الحصول على مجموعة من الفطريات ومن ضمنها عزلة من الفطر الإحيائي T. hamatum وأعطيت الرموز T.a وعزلة من الفطر T. konngi وأعطيت الرموز T.r للعزلات على النبات الذي اخذت منه وهي الخيار والطماطة على التوالي. وتم اختبار كفاءتها التضادية بالاضافة الى عزلتين من T. harzianum من ضمنها عزلة التحدي وايضا T. veride ضد الفطر الممرض M.phaseolina وكذلك في التجارب المختبرية اللاحقة واختيرت العزلة ذات الكفاءة التضادية العالية لاستخدامها في بعض تجارب الأصص اما الفطر Glomus sp فقد تم الحصول عليه من دائرة البحوث الزراعية – وزارة العلوم والتكنولوجيا وهو عباره عن ( تربة +جذور + ابواغ الفطر ).
الدكتور عبدالنبي عبدالامير قسم وقاية النبات -كلية الزراعة -جامعة البصره
ساحة النقاش