تنقية الفيروسات النباتية virus purification
الغرض من عملية التنفية
فصل الجزيئات الفيروسية عن المكونات النباتية وتركيز هذه الجزيئات وتعتمد هذه العملية على الصفات الكيماوية والطبيعية او الاثنين معا لكلا من الفيروس والعائل النباتى ونظرا لاختلاف خواص الفيروسات عن بعضها واختلافات طبيعة العوائل فانه لا توجد طريقه معينة اوثابتة يمكن استخدامها لتنقية حميع الفيروسات .
درجه النقاوة تعتمد على الغرض الذى تتم من اجلة عملية التنقية فى حالة دراسة الصفات الطبيعية او الكيماوية يجب ان تكون التنقية كاملة اما فى حالة انتاج امصال مضادة او دراسة الخواص السيرولوجية فان التنقية قد تكون جزيئية partial purification
نجاح عملية التنقية يعتمد على
· ان يحتوى مستخلص النباتات المصابة على تركيز عالى من الفيروس نظرا لفقد اجزاء منها اثناء اجراء الخطوات
· ان يكون هناك اختلاف بين الجزيئات الفيروسة وبين المحتويات النباتية حتى يمكن فصلها
· ان يكون الفيروس ذو درجة عالية من الثبات حتى يمكنة تحمل الخطوات المختلفة لعملية التنقية
الشروط التى يجب مراعاتها قبل اجراء عملية التنقية
اولا - الشروط الواجب توافرها في النبات العائل المستخدم فى اكثار الفيروس propagative host هي:
1. سهولة زراعة وتكاثر النبات العائل ووفرة المحصول الورقي.
2. سهولة اجراء العدوى للنبات العائل.
3. سهولة استخلاص العصير منه.
4. سهولة انتقال الفيروس داخل انسجتة المختلفة خصوصا انسجتة الوعائية
5. خلوه من الصبغات القاتمة التي تنشر في العصير النباتي
6. خلوه من المثبطات التي توثر في نشاط الفيروس خاصة بعد خروجها واستخلاصها من الخلية.
7. خلوه من البروتينات غير النشطة ذات الجزيئات المتشابهة شكلا وحجما من الجزيئات الفيروسية المراد استخلاصها من الخلية مثل الريبوسومات.
8. ان يحتوي على نوع واحد فقط من الفيروسات أي خالي من التلوث بفيروسات اخرى.
ثانيا:- اختيار السلالة الفيروسية:
في حالة الفيروسات التي يكون لها أكثر من سلالة فيروسية يلزم تحديد السلالة ويشترط في حالة اختيار السلالة الفيروسية توفر الشروط التالية:
1- غزارة إنتاجها من الجزيئات الفيروسية .
2- توفر الصفات التي تساعد على إجراء عمليات التنقية مثل مقاومتها للتحلل وثبات خواصها الطبيعية.
3- ثباتها الوراثي (وهو قدرتها على الاحتفاظ بصفاتها الوراثية بدون تغير أو حدوث طفرات اثناء فترة التنقية والدراسة).
4- عدم ارتباطها بالبروتينات النووية للعائل أو الربيوسومات.
5- قدرتها العالية على إصابة العوائل المختلفة وسرعة ظهور أعراض الإصابة على العوائل التي تتطفل عليها
تشمل عمليات التنقية للفيروسات المختلفة النقاط الاتية:-
• تعتمد على كيمياء البروتين للحصول على تحضيرمتجانس (اى تحضير يحتوى على مكون واحد كل على حده فيه مكونة من جزيئات موحدة التركيب الكيميائي ).
• الطرق المتبعة هي:-
1- فصل المواد الغربية
2- فصل جزيئات الفيروس من المخلوط
3- فصل المخلوط الى محتويات مختلفة والذي منها واحد او اكثر يحتوي الفيروس.
ثالثا:اختيار طريقة التنقية المناسبة:
1. استخلاص العصير الخام للنبات المصاب.
2. ترويق العصير المصاب .
3. الحصول على الفيروس (ترسيب وتجميع الفيروس).
ملاحظة: يجب المراعاة عند تنقية بروتين الفيروس معرفة درجة ثبات البروتين في درجات الحرارة المختلفة ودرجات تركيز أيون الهيدروجين pH المختلفة.
اولا: استخلاص العصير النباتي:-
1. جمع الانسجة النباتية المصابة التى يكون تركيز الفيروس عالى تجهيز العصير النباتي ويمكن ان بتم تجميدها .
2. طحن العصير فى الهون او الخلاط او المفرمة فى البفر المناسب بكمية وتركيز مناسب.
3. تصفية العصير خلال طبقتين من الشاش او الموسلين للتخلص من جزيئات النبات الكبيرة .
4. ينقل إلى انابيب الطرد المركزي ويراعي ان يكمل الحجم في انبوبة الطرد إلى 6 مل من المحلول المنظم.
ثانيا: ترويق العصير:
1-يتم عمل الطرد المركزي البطىء low speed centrifugation عند 3000 لفة في الدقيقة لمدة 5- 30 دقيقة.
2-ينقل الرائق من الأنبوبة الى أنبوبة طرد أخرى ثم يضاف لها 0.5 مل من الكلورفورم ثم يتم الرج جيداً لمدة 5 دقائق,ثم يعمل لها طرد المركزي عند 3000 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق مباشرة بعد الرج.
ثالثا: ترسيب وتجميع الفيروس:
1. بعد عملية الترويق ، يتم نقل الرائق الى انبوبة طرد اخرى وعلى حسب حجم الرائق من العصير يضاف اليه نصف حجمه من محلول كبريتات الامونيوم المشبعة ثم يترك لمدة 24 ساعة في الثلاجة.
2. ثم يعمل طرد مركزي عند 9000 لفة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة
3. يتم التخلص من الرائق اما الراسب فيضاف له محلول منظم بكمية معلومة ويترك ساعة ثم يعمل لها طرد مركزي عند 6000 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة
4. يتم حقن الميكانيكي للعائل المناسب ثم ينقل في الصوبة.
5. يتم متابعة ظهور الأعراض مع تسجيل تاريخ الحقن وتاريخ ظهور كل عرض ونوعه.
ساحة النقاش