مراحل زراعة الأنسجة

للوصول إلى الأهداف السابقة الذكر فإن هناك ثلاثة مراحل رئيسية للحصول على زراعة ناجحة للأنسجة وهى:



أولاً: الحصول على مزرعة معقمة Stage І : Establishment of a septic culture



هذه المرحلة هامة جداً وتعتبر من أهم مراحل زراعة الأنسجة والغرض منها ببساطة هو الحصول على مزرعة معقمة بمعنى عدم تلوث البيئة الغذائية المستعملة أو الأنسجة المستخدمة فى الزراعة Explants بأى كائن دقيق يسبب تعفنها وموتها . ويأتى ذلك بتعقيم الأدوات المستعملة وتعقيم البيئة المستخدمة وكذلك تعقيم الأنسجة المستعملة والتى تكون عبارة عن أجزاء من النبات المراد إكثاره مثل القمم النامية للسيقان والجذور أو أجزاء من السيقان أو الأوراق أو نسيج الكلس ..............الخ. ثم إتمام الزراعة أيضاً فى جو وحيز معقم.



ثانياً: زيادة الأعضاء المتكاثرة Stage П : Multiplication of propagula

لهدف من تلك المرحلة هو زيادة الأعضاء والتراكيب التى تعطى فى النهاية النبات الكامل لذلك تعتمد تلك الخطوة على زيادة إنتاج الأعضاء العرضية Adventitious organs أو زيادة تكوين الأجنة أو زيادة تنشئة النموات الجانبية Axillary shoots وعندما يكون الكلس خطوة وسطية يكون الهدف فى تلك المرحلة هو زيادة نمو الكلس ثم تخليق النموات العرضية الخضرية منها أو تكوين الأجنة الجسمية Somatic embryo والجدول (2) يبين الطرق المختلفة لزيادة Propagula فى هذه المرحلة Stage



جدول (2) أهم النباتات التى نجحت بزراعة الأنسجة ومصدر المنفصل النباتى وطرق تضاعفها



Methods of Multipication
Explant Source
Plant

Alliaceae

Callus, Adventitious bulb
Aerial bulb scale
Allium capa

Asteraceae

Callus, Adventitious shoots
Stem, Shoot tip
Chrysanthemum morifoliume

Axillary shoots
Shoot tip
Gerbera jamesonii

Adventitious shoots
Cotyledon, Hypocotyl, Root
Lactuca sativa

Bogoniaceae
Adventitious shoots
Leaf
Begonia rax

Rosaceae

Adventitious shoots
Stem
Rosa sp

Brassicaceae

Adventitious shoots
Leaf, Stem, Root
Brassica laraceae

Eubiaceae

Callus, Asexual embryo
Stem
Coffea arabica

Rutaceae

Asexual embryo
Nucleus tissue
Citrus sp

Convolvulaceae

Adventitious shoots, Callus
Stem, Root
Convolvulac arvensis

Solanaceae

Adventitious shoots, Callus
Anther
Solpiglassis sinuata

Callus, Asexual embryo
Embryo
Solpiglassis melongena

Adventitious shoots
Leaf
Solpiglassis nigrum

Adventitious shoots
Tuber
Solpiglassistuberosum

Adventitious shoots, Callus
Leaf, Stem
Nicotiana tabacum

Adventitious shoots, callus, Asexual embryo
Leaf, Root
Atropa balladona

Geraniaceae

Adventitious shoots, Callus
Stem, Shoot tip, Anther Pelargonium hortorum

Cucurbitaceae

Callus, Asexual embryo
Cotyledon, Hypocotyl
Cucurbita pepo






ثالثاً: الإعداد لنقل النبات للتربة Stage Ш : Preparation of re-establishment of plant

يمكن اعتبار أن التكاثر عن طريق زراعة الأنسجة ناجحاً إذا توج بنجاح نقل النبات الناتج فى الأنبوبة المعقمة إلى التربة واستمرار نموه وللوصول لهذه الغاية يجب العمل على أقلمة أو تقسية النباتات Hardening of plant قبل نقلها للظروف الصعبة المحتمل أن تواجهها فى التربة مثل نقص الرطوبة Stress tolerance to moisture خاصة إذا علمنا أن تلك الأنسجة تعتبرنامية فى وسط مائى Heterotrophic وسوف تنتقل إلى وسط آخر Autotrophic state . كذلك يجب استيفاء تلك النباتات لاحتياجاتها الحرارية أن وجدت لإنهاء طور الراحة كما للأبصال وللكورمات والريزومات احتياجات البرودة Chilling requirement فيجب استيفاءه قبل نقلها للتربة .



احتياجات كل مرحلة Requirements of each stage :

إحتياجات كل مرحلة تشمل احتياجات غذائية بمكونات البيئة وطبيعتها واحتياجات بيئية أى تعرض الأنسجة لدرجات حرارة وشدة إضاءة معينة. وعند دراسة المرحلة الأولى يجب ألا نغفل أن نجاح التكنيك يعتمد أساساً على حسن اختيار الجزء المنزرع Explants أما المرحلة الثانية فإن نجاحنا يتحدد بمعرفتنا إلى طريقة زيادة الأعضاء العرضية المتكونة مثل النموات العرضية والأجنة الخضرية والنموات الجانبية ..الخ. أما فى المرحلة الثالثة فيجب أن نكون ملمين بالاحتياجات الفسيولوجية للنبات المتكون كاحتياجه مثلاً لكسر طور سكونه إن كان له طور سكون أو احتياجه إلى معاملات خاصة للتقسية مثل تعريضه إلى إضاءة ذات شدة عالية High intensity light .



وفى جدول 3 سوف نسوق ثلاث أمثلة لنباتات Bromeliads, Gerbera, Asparagus لتوضيح احتياجات كل مرحلة من الهرمونات والاحتياجات البيئية وكذلك طبيعة البيئة الغذائية لكل لنبات .


جدول (3) يوضح أهم الاحتياجات المصاحبة لكل مرحلة من مراحل زراعة الأنسجة لثلاثة من النباتات

Characteristic
Asparagus
Gerbera
Bromelaids

Stage І

- - Explant
O.15mm shoot tip
2- 3mm shoot tip
Lateral bud

- Medium
Agar, Ms salts + O.3mg NAA+O.1 Kinetin
Agar, Ms salts 0.5IAA+ 10 Kinetin
Liquid, 1 rpm

1.75IBA+1.75NAA+

150mg/L citric acid

- culture environment
27c, 16 hr daily 1000LUX
27c, 16 hr, l000LUX
27c 16 hr, LUX

Stage П

- Method of Multiplication
Axillary shoot,

adventitious root
Axillary shoot
Adventitious shoot

- Medium
None change
None change
Liquid MS, 2 IAA+2K 80mg/L adenine sulfate 170mg/LNaH2PO4H2O

- Culture Environment
None change
None change
None change

Stage Ш

- Medium
Remove NAA
Remove Kinetin increase IAA to l0mg/L
Remove K, Adenine sulfate, NaH2 PO4. H2O

- Culture Environment
Increase light to 10,000 LUX
Increase light to10,000 LUX
Increase light 3000 LUX