دراسات تكميلية عن عدوى ميكروبات الأيروموناد المتحركة فىأسماك المياه العذبة

رسالة مقدمة من

ط.ب./ فيولا حسن زكى

(بكالوريوس العلوم البيطرية – جامعة الاسكندرية 1987، ماجيستير صحة وأمراض الأسماك 1999).

للحصول على درجة دكتوراه الفلسفة فى العلوم الطبية البيطرية ( صحة وأمراض الأسماك).

لجنة الحكم والمناقشة

أ.د./ حاتم صلاح الدين عبد الحميد

( أستاذ ورئيس قسم طب الطيور والأسماك – كلية الطب البيطرى – جامعة الاسكندرية)

أ.د./ محى السعيد عيسى

(أستاذ باثولوجيا الأسماك – كلية الطب البيطرى – جامعة القاهرة)

أ.د./ احمد على سامى (مشرفاً)

( أستاذ متفرغ بقسم طب الطيور والأسماك – كلية الطب البيطرى – جامعة الاسكندرية)

الملخص العربى:

تم عمل دراسات تكميلية لدراسة خواص بعض معزولات الأيروموناد المتحركة والمعزولة من أسماك المياه العذبة وتقييم بعض المركبات المناعية المجهزة لمقاومة عدوى الأيروموناس هيدروفيلا فى أسماك المياه العذبة.

وتتلخص النتائج فيما يلى:

<!--كشفت العدوى التجريبية بجراثيم 7 معزولات مختارة من الأيروموناد المتحركة والمحقونة عضلياًً بواقع 3x10 7 خلية حية لكل سمكة من أسماك المبروك العادى عن أن المعزولات من الأيروموناس هيدروفيلا من المجموعة11)  ( HG 1, serogroup 0. والأيروموناس فيرونى من المجموعة (H G 10)  والأيروموناس هيدروفيلا النمطى (ATCC 7966)  من المجموعة ( HG 1)  ولا ينتمى للمجموعة المصلية (Serogroup 0.11)  هو وحدها الممرضة والتى أدت إلى ظهور أعراض اكلينكية ووفيات تراوحت بين 60-80%. وفى المقابل لم تستطع أى من الأيروموناس جاندى من المجموعة (HG 9) والأيروموناس سوبريا من المجموعة (HG 7)  والأيروموناس سوبريا من المجموعة (HG 8 X)  والأيروموناس كافى من المجموعة (HG 5 a, non – serogroup 0.11) من احداث أعراض أو وفيات فى الأسماك المحقونة بها.

<!--لم يؤدى الحقن العضلى للمستحضرات السمية الخارجية المنقاه جزئياً لكل من المعزولات الثلاثة الضارية السابق ذكرها فى أسماك المبروك العادى الى احداث أى أعراض، بينما استطاعت سموم الأيروموناس هيدروفيلا ( Serogroup 0.11)  الغير منقاه من إحداث بقع نزفية فى موضع الحقن والسموم الغير منقاه للأيروموناس فيرونى من احداث منطقة غامقة فى موضع الحقن أيضاً ولم تستطع السموم الغير منقاه للأيروموناس هيدروفيلا النمطى ( ATCC 7966) من إحداث أية أعراض.

<!--كشفت دراسة التأثير الأتلافى المذيب للسموم الغير منقاه أو المنقاه جزئياً لكل من سبع معزولات من الأيروموناد المتحركة على الكرات الدموية الحمراء ( haemolytic activity) لأربع عوائل مختلفة على درجة 22 درجة مئوية عن أن السموم المنقاة جزئياً والغير منقاه للأيروموناس هيدروفيلا ( Serogroup 0.11)  استطاعت خلال 15 دقيقة من إذابة كرات الدم الحمراء لأسماك القرموط والحمام والدجاج والحصان. وفى المقابل استطاعت السموم الغير منقاه فقط لكل الأيروموناس هيدروفيلا النمطى (ATCC 7966) والأيروموناس جاندى من إذابة كرات الدم الحمراء لأسماك القرموط والحصان خلال 60 دقيقة.

<!--أدت دراسة تحديد الوزن الجزيئى للسموم الخارجية والداخلية المنقاه جزئياً لعدد 6 أنواع مختلفة من الأيروموناد المتحركة باستخدام التحليل الكهربائى ( SDS –PAGE) إلى التعرف على 7 شرائط من البروتينات بوزن جزيئى يتراوح بين 38 – 14 كيلو دالتون للسموم الخارجية للأيروموناس هيدروفيلا (Serogroup 0.11). وتم التعرف على شريط واحد فقط للسموم الخارجية للأيروموناس كافى ( HG5, non – serogroup 0.11) بوزن جزيئى قدره 14 دالتون بينما تم التعرف على 3 شرائط للسموم الخارجية لكل من الأيروموناس فيرونى (HG10) والأيروموناس سوبريا (HG7) بوزن جزيئى يتراوح بين 23 – 14 كيلو دالتون. ولم تظهر أى أشرطة للسم الخارجى للمعزول الأيروموناس سوبريا من المجموعة (HG 8X) فى المدى بين 94 – 14 كيلو دالتون.

وبالنسبة للوزن الجزيئى للسموم الداخلية للأيروموناد المتحركة فان مداها لم يقع فيما بين 94 – 14 كيلو دالتون ومن ثم لم تظهر أى أشرطة بالتحليل الكهربائى (SDS – PAGE).

<!--كشف اختبار مدى التصاق سبع معزولات من الأيروموناد المتحركة المختارة للمخاط الخارجى لأسماك كل من القرموط والمبروك العادى عن أن الأيروموناس كافى (HG non-serogroup 0.11)  وحدها ليست لديها قدرة الالتصاق للمخاط الخارجى لنوعى الأسماك بينما كان الالتصاق شديداً (متوسط عدد الميكروبات فى كل 1 مم 2 ) لكلا نوعى المخاط من الأيروموناس شوبرتى ( GH 12)  كما وجدت درجات متفاوتة من الالتصاق لكلا النوعين من المخاط بين الأنواع الأخرى للأيروموناد المتحركة.

<!--كان محتوى البروتين والليزوزيم للمخاط الخارجى لأسماك القرموط (0.02 صفر وحدة دولية على التوالى) أقل كثيراً منهما فى أسماك المبروك العادى (2، 0.05 وحدة دولية على التوالى).

<!--لم يستطع أى من السموم الداخلية الغير منقاه لكل من سبع أنواع مختارة من الأيروموناد المتحركة إحداث أعراض أو آفات تشريحية مرئية عند حقنها فى التجويف البريتونى لأسماك المبروك العادى. كذلك لم يستطع أى منها وقاية أسماك البلطى النيلى عند اجراء تحدى المناعة باستخدام المعزول النمطى الضارى (ATCC 7966).

<!--فشل حقن التوكسويد المعامل بالفورمالين والمحضر من معزول الأيروموناس هيدروفيلا (Serogroup 0.11) فى التجويف البروتينى فشلاً كاملاً فى وقاية أسماك البلطى بعد أربع أسابيع من حقنه عند اجراء اختبار التحدى بالحقن عضلياً بذات نوعية الجراثيم الضارية، بينما استطاع البكتيرين المعامل بالفورمالين والمستخدم كلقاح بالحقن فى البريتون وقاية 80% من الأسماك المحصنة ضد الوفيات عند اجراء اختبار التحدى عضلياً بالعترة الضارية بعدى أربع أسابيع من التحصين.

<!--عقب اجراء اختبار التحدى العضلى فى احدى التجارب عند الأسبوع الثالث والرابع بعد التحصين بمستحضر البكتيرين للأيروموناس هيدروفيلا (Serogroup 0.11) والمحقون إما فى التجويف البريتونى أو المعطى مخلوطاً بالعلف فى أسماك البلطى بدأ ظهور تأثير الوقاية من الأمراض أو النفوق الناتج عن التحصين، ووصل إلى ذروته (نسبة وقاية 100%) فى الأسبوع السادس والسابع بعد التحصين. هذا وقد كانت القيمة الوقائية للقاح المحضر، والتى حصلنا عليها بطرح نسبة الأحياء للأسماك الغير محصنة من نسبة الأحياء فى الأسماك المحصنة، كانت هذه النسبة 50،40 % للأسماك المحصنة بالحقن فى التجويف البريتونى والمعطاه عن طريق الفم على التوالى.

<!--[if !supportLists]-->10. وجد فى تجربة أخرى باستخدام نفس اللقاح ونفس طرق اعطائه السابقة أنه عند اجراء اختبار التحدى عن طريق الفم كانت القيمة الوقائية للقاح أقل (62.5%) منها عند استخدام الحقن عضلياً (75 – 87%) فى الاسبوع السابع بعد التحصين، وبغض النظر عن طريقة التحصين. وانخفضت القيمة الوقائية للقاح عند الاسبوع ال16 بعد التحصين إلى 40% و 60% فى الأسماك المحصنة بالحقن فى التجويف البريتونى وبطريق الفم على التوالى وذلك عند اجراء اختيار التحدى بطريق الحقن عضلياً، وانخفضت إلى 20% فى كلا طريقتى التحصين عند اجراء اختبار التحدى عن طريق الفم.

وفى هذه التجربة أفرزت الأسماك الغير محصنة جراثيم التحدى فى البيئة (المياه) لمدة 6-9 أيام أو 8-10 أيام عقب تعرضها لاختيار التحدى بالفم أو بالعضل على التوالى. وفى المقابل كان افراز جراثيم التحدى فى البيئة للأسماك المحصنة بأى من الطريقتين لمدة 3-5 أيام أو لمدة 3-10 أيام عقب اختبارات التحدى عن طريق الفم أو بالحقن فى العضل على التوالى.

وكان منسوب الأجسام التلبدية (agglutinating antibody) ضد الأيروموناس هيدروفيلا (Serogroup 0.11)  فى مصل الأسماك الغير محصنة ثابتاً تقريباً ولم يتخطى 22 طيل التجربة (7 أسابيع) ووصل ذروته (2 4 ، 2 8 ) عند الأسابيع 4،5 بعد التحصين عن طريق الفم أو بالحقن فى البريتون على التوالى. كما كان منسوب الأجسام التلبيدية المضادة فى مخاط سطح الجسم للأجسام المحصنة أقل كثيراً عنه فى مصل الدم لم يختلف إختلافاً بيناً عما كان عليه نظيره فى الأسماك الغير محصنة.

هذا وقد استحدثت طريقة لإختيار الأليزا (ELISA) فى تقييم الأجسام المناعية ضد الأيروموناس هيدروفيلا فى مصل الدم بجانب اختيار التلبد الدقيق (Microagllutination).

<!--[if !supportLists]-->11. وجد أن إعطاء لقاح ( البكتيرين) الأيروموناس هيدروفيلا لم يؤثر على معدلات النمو تأثيراً معنوياً وذلك بمقارنة الأسماك المحصنة بالغير محصنة.

<!--[if !supportLists]-->12. أدى تحصين البلطى النيلى باستخدام جراثيم الأيروموناس كافى(Serogroup 0.11) الحية والغير ضارية عن طريق الفم أو بالحقن فى البريتون إلى إحداث مناسيب جيدة من الوقاية حيث تراوحت قيمة الوقاية بين 55.5% إلى 77.7% عند اجراء اختبارات التحدى بالحقن عضلياً أو بطريق الفم وذلك باستخدام عترة ضارية غير مماثلة من جراثيم الأيروموناس هيدروفيلا من نفس المجموعة المصلية (Serogroup 0.11) عند الاسبوع الخامس بعد التحصين.

وكان منسوب الأجسام التلبدية المضادة فى مصل الدم أعلى عند اختبارها ضد الجراثيم المماثلة عنها ضد الجراثيم الغير مماثلة من الأيروموناس هيدروفيلا (Serogroup 0.11).

<!--[if !supportLists]-->13. كانت المحصلة لنتائج الدراسات التجريبية عند التحصين ببكترين الأيروموناس هيدروفيلا (Serogroup 0.11) عن طريق الفم خلطاً بالعليقة بصفة عامة، وبجراثيم الأيروموناس كافى (Serogroup 0.11) الحية والغير ضارية والمعطاه عن طريق الفم أيضاً ( خلطاً بالعليقة) بصفة خاصة تبدو عملية جداً ومشجعة بالنسبة للوقاية من عدوى جراثيم الأيروموناد المتحركة الضارية من نفس المجموعة المصلية فى أسماك المياه العذبة المستزرعة. ومع ذلك فإنه يلزم دراسات أخرى مستقيضة لتحسين وإطالة أجل القيمة الوقائية لهذه اللقاحات.

إعداد/ أسماء أحمد

مراجعة/ أيمن عشرى

إشراف م./ زينب عثمان