طرق تثبيت الخلايا Methods of cell immobilization
هناك عدد كبير من طرق تثبيت الخلايا ولكن التقنيات المستخدمة على المستوى التجاري حتى الآن يمكن تقسيمها إلى قسمين رئيسيين وهما طرق الربط على حامل ن و طرق الحبس
طرق الربط على حامل Carrier binding methods
تعتمد هذه الطرق على الربط المباشر للخلايا على حوامل غير ذائبة في الماء عن طريق الادمصاص الفيزيائي أو الروابط الأيونية أو الروابط التساهمية. قد تكون الحوامل المستخدمة عديدات التسكر مثل السليولوز والدكستران ومشتقات الأجاروز، أو بروتينات مثل الجيلاتين والألبيومين أو مواد محضرة صناعياً مثل المواد الراتنجية والـ polyvinylchloride أو قد تكون مواد غير عضوية مثل الرمل والزجاج.
وادمصاص الخلايا على الحوامل يعتمد في المقام الأول على تفاعـل القـوة الكهربائيـة السـاكنـة Electrostatic interactions وعلى الروابط الأيونية والهيدروجينية بين سطح الخلية والمادة الحاملة. وبالنسبة للارتباط الكيماوي فهو عبارة عن ارتباط تساهمي مباشر للخلايا على الحامل وفي هذه الحالة لابد من إحداث تعديل كيماوي لسطح الحامل بحيث يصبح نشط ويرتبط بالمجموعات الكيماوية الموجودة على سطح الخلية مثل مجموعة الكربوكسيل أو الفينول أو الهيدروكسيل.
طرق الحبس Entrapping methods
درست هذه الطرق بشكل واسع جداً وهي عبارة عن عمل كبسولات من مادة صناعية نسيجية تكون جل مثل ألجينات الكالسيوم Calcium alginate و البولي أكريلاميد و الكاراجينن k-Carrageenan و تحبس الخلايا داخلها, وسوف نلقي الضوء على واحدة فقط وهي عمل كلسولات من ألجينات الكالسيوم
عمل كبسولات من ألجينات الكالسيوم Calcium alginate
هي أكثر المواد شيوعاً واستخداماً في عملية تثبيت الخلايا وتستخرج من الأعشاب البحرية وتتحول إلى جل عن طريق بعض الأيونات وخصوصاً الكالسيوم. ويمكن تلخيص أسباب شيوع استخدام الألجينات في تثبيت الخلايا فيما يلي :
1- يمكن استخدام ألجينات مختلفة الأوزان الجزيئية ومختلفة التركيب الكيماوي .
2- تركيز الألجينات المستخدمة يمكن أن يتراوح من 0.5-10% .
3- تركيز كلوريد الكالسيوم المستخدم في تكوين الجل يتراوح من 0.05% إلى 2% .
4- درجة الحرارة المستخدمة تتراوح من صفر إلى 80 درجة مئوية .
5- يمكن الحصول على خرز Beads يتراوح قطر كل واحدة من 0.1 إلى 5 مليمترات .
6- يمكن الحصول على خرز به أعداد هائلة من الخلايا الحية النشطة والتي تظل محتفظة بحيويتها ونشاطها لفترة طويلة .
7- عملية التثبيت تتم في خطوات بسيطة جداً وغير مكلفة .
وفيما يلي خطوات عملية تثبيت خلايا الخميرة Saccharomyces cerevisiae كمثال عملي لهذه الطريقة بغرض استخدامها في إنتاج كحول الإيثانول :
1- تحضر ألجينات الصوديوم 4 - 5% (وزن/حجم) ثم تعقم ثم تترك لتبرد حتى 40-45°م.
2- يخلط حجم من محلول ألجينات الصوديوم مع حجم مماثل من معلق الخلايا النامية في بيئة صناعية سائلة والتي تحتوي على عدد ضخم من الخلايا /مل.
3- يرج الخليط جيداً ثم ينقط من خلال أنبوبة ضيقة في محلول 0.05 مول كلوريد كالسيوم عند درجة حرارة 37°م فتتكون في الحال كرات تشبه الخرز يتوقف حجمها على قطر فتحة الأنبوبة المستخدمة في التنقيط .
4- يترك الخرز لمدة ساعة ليتماسك وذلك على درجة 20-22°م ثم يغسل بالماء ويترك لليوم التالي في محلول 0.05مول كلوريد كالسيوم على درجة حرارة 4°م .
5- يمكن استخدام الخلايا المثبتة بهذا الشكل مباشرة في عملية الإنتاج .
يتم تنفيذ المثال السابق على مستوى المعمل وفي معظم الأبحاث التي ما زالت تحسن وتطور في عملية التثبيت. ولكن على المستوى الصناعي يتم إنتاج الخلايا المثبتة بأشكال كثيرة وتقنيات مختلفة ولكن لها نفس الأساس الذي تم شرحه. قد تكون الخلايا المثبتة في صورة غير نشطة ولا تستمر في النمو بعد التثبيت وقد تكون نشطة وتستمر في النمو بعد التثبيت وقد وجد أن الخلية المثبتة النشطة تنتج إيثانول بدرجة أسرع من الخلايا غير النامية وذلك في التخمر المتقطع مما جعل العلماء يعتقدون أن بعض من مغذيات الخميرة قد يكون ضروري بالنسبة للخلايا المثبتة. وقد أكد العلماء على حدوث إنتاج سريع للإيثانول بواسطة الخلايا المثبتة عندما أضيف مستخلص فول الصويا إلى البيئة وهذا ربما يرجع إلى وجود مشتقات البروتين والليبيدات في مستخلص فول الصويا. ويجب أن يكون هناك حذر من تراكم ثاني أكسيد الكربون في المخمر للتأكد من أن إنتاجية الإيثانول ستظل ثابتة. وقد فسر العلماء أن زيادة كفاءة التخمر عند استخدام الخلايا المثبتة قد تعود في أحد أسبابها إلى أن هذه الخلايا لا تتعرض بشكل مباشر لتأثير الإيثانول المنتج وبالتالي لا توجد مشكلة عدم تحمل الإيثانول المنتج.
وفي مجال تطوير طرق تثبيت خلايا الخميرة قام كاتب هذه السطور ( Zayed, 1997) بإدخال بعض الزيوت النباتية مثل زيت الزيتون وزيت الذرة وزيت عباد الشمس على نظام التثبيت بالألجينات فيصبح هذا النظام قادراً على جعل الخلايا مقاومة للمواد السامة. وذلك لأن الخرز المحتوي على الخميرة يكون له وجهان، وجه مائي تتركز فيه المواد الغذائية وبالتالي تتركز فيه خلايا الخميرة ووجه زيتي وهو مغلف لكل خرزة من ناحية السطح ولذلك إذا ما وضعت الخرزة الجيلاتينية المحتوية على الخلايا في بيئة تحتوي على كيماويـات سامـة فإن هذه الكيماويات تدمص على الطبقة الزيتية قبل أن تتغلغل داخل الخرزة وتصل إلى الخلايا. وعلى ذلك فقد أمكن استخدام هذه الكيماويات السامة في تعقيم البيئات كبديل للحرارة مع استخدم هذا النظام كلقاح لا يتأثر بوجود هذه المواد السامة.
ساحة النقاش