<!--<!--<!--<!--

طرق التعديل الوراثي في الدواجن

د/صلاح الدين عبد الرحمن الصفتي

1- طريقة الحقن المجهري للمادة الوراثية DNA microinjection

هي طريقة طبيعية Physical method يتم فيها حقن المادة الوراثية المُختارة والمُميزة داخل نواة البويضة المُخصبة المُراد تعديل مادتها الوراثية، ويُعد أنسب وقت لإجراء الحقن بالمادة الوراثية داخل البويضة المُخصبة هو الوقت بعد ساعتين ونصف من إحداث عملية التبويض Ovulation، أي بعد ساعتين وخمسة وأربعون دقيقة من وضع البيضة السابقة، حيث في هذه المرحلة يكونا كل من نواتي الذكر والأنثى كبيرة الحجم وتقعان في موضع مركزي واضح. وقد أوضح Naito et al. (1994) أن الشكل الخطي للمادة الوراثية يُسهل من حقنه داخل القرص الجرثومي Germinal disc للبويضات المُخصبة، ويُمكن لهذا الجنين المحقون نموه وتطوره معملياً In vitro حتى مرحلة الفقس. صاحب عملية النقل الجيني باستخدام تقنية حقن المادة الوراثية نجاحات ضئيلة، حيث تراوحت مُعدلات الفقس في الكتاكيت المحقونة بين 5- 10%، كما وجدت المادة الوراثية المحقونة في عدد قليل جداً من الأفراد الفاقسة.

زراعة الأجنة معملياً Ex-Vivo embryo culture

تم استخدام هذه التقنية بواسطة Ferry (1988)، حيث قام بزراعة أجنة دجاج معملياً حتى مرحلة الفقس، وأعاد Naito and Perry (1989) هذه الطريقة بعد إجراء بعض التعديلات عليها، حيث تضمنت هذه الطريقة الحصول على بويضات مُخصبة في حاويات زجاجية وتحضينها في مزرعة وسطية لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 41°م، ثم بعد ذلك تم نقلها إلى بيض صغير وكبير الحجم وتحضينه عند درجة حرارة 38°م حتى الفقس. أن استخدام تقنية زراعة الأجنة في الدجاج ساعدت في الوصول إلى الأجنة في مراحلها المُبكرة، وبالتالي إمكانية التعامل معها ودراستها.

2- استخدام الدجاج الخُرافي Use of Chimeric Chicken

تشمل تلك الطريقة مدخلين هامين: الأول طريقة نقل الخلايا الجنينية، والثاني طريقة نقل الخلايا الجرثومية الأولية، وسوف نلقي الضوء على كليهما فيما يلي:

طريقة نقل الخلايا الجنينية Blastodermal cell transfer

عند تضاعف ونمو الخلايا الجنينية، يُمكن عندئذ نقلها من جنين إلى أخر، ولكن بعد تعيين التتابع الجيني بها، حيث لوحظ بعد عملية النقل نمو خلايا جنينية مُعدلة وأخرى غير مُعدلة. بشكل عام إذا انتقلت الخلايا الجنينية بثبات واستقرت داخل الخط الوراثي للجنين المُستقبِل، سوف يؤدي ذلك إلى توريث الجينات المنقولة عبر الأجيال، وفي هذا الإطار حقق كل من Brazolot وآخرون (1991)، Fraser وآخرون (1993) بعض النجاحات باستخدام هذه الطريقة.

طريقة نقل خلايا جرثومية أولية Primordial germ cell transfer

تُعد الخلايا الجرثومية الأولية هي المُنجبات أو البادئات لكل من البويضات والحيوانات المنوية عبر مرورها بعدة مراحل، وتُعتبر عملية زرع خلايا جرثومية أولية ونقلها إلى حيوانات مُستقبلة Recipient هي أحد طرق التعديل الوراثي، وقد أمكن تحسين كفاءة تلك الطريقة عن طريق التخلص من الخلايا الجرثومية الأولية باطنية النمو Endogenous. حصُل Naito وآخرون (1995) معملياً على خلايا جرثومية أولية من دم جنيني، وتم نقلها مرحلياً إلى أجنة مُستقبلة عقيمة Sterilized recipient embryos، وقد لوحظ ظهور تعبير المادة الوراثية المنقولة في التركيب الوراثي للجنين المُستقبل.

- استخدام النواقل Use of vectors

الحيوان المنوي كناقل جيني وسيط

Sperm mediated gene transfer

يُمكن توظيف الحيوان المنوي واستخدامه بشكل جيد كناقل جيني داخل قطعان الدجاج، حيث تُعتبر الحيوانات المنوية بمثابة عوامل تحضين مُساعدة Co-incubated ، للجينات خارجية المنشأ Exogenous، والتي تم حقنها في نواة الحيوان المنوي، حيث يُمكن نقلها للإناث بواسطة التلقيح الاصطناعي Artificial  insemination (AI)، وقد أمكن باستخدام هذه الطريقة إدخال المادة الوراثية الغريبة Exogenous DNA في الخلايا المُخصبة (Naito, 1996).

فيروسات الرترو كناقل جيني وسيط

Retrovirus mediated transfer

عند استخدام فيروسات الرترو كنواقل لإنتاج الدجاج المُعدل وراثياً، اقترح Flamant وآخرون (1996( تقنيتين لاستخدام هذه الطريقة: الأولى تتضمن عملية الاستيعاب الاندماجي Transfection لخلايا البلاستودرم باستخدام نواقل فيروسات الرترو، وإعادة زرعها بالجنين المُستقبل المُعَالج بأشعة جاما Gamma irradiated recipient embryo. الطريقة الثانية تُعرف بالاندماج الفيروسي Virofection، وتشمل إجراء عملية اندماج استيعابي لخلايا البلاستودرم بواسطة بلازميد Plasmid يحمل أنواع مختلفة من فيروسات الرترو قبل عملية إعادة الزرع Re-implantation. تعمل كلتا التقنيتان السابقتان على إعطاء قدر كبير من الدمج والتكامل Integration، ولكن أهم ما يُصاحب هذه الطرق من إشكاليات هي حجم المادة الوراثية خارجية المنشأ المُستخدمة، والتأثير المُسرطن Oncogenic المُصاحب المُحتمل.

الخلايا الجذعية الجنينية كناقل جيني وسيط

                             Embryonic stem cells mediated transfer

تشتمل تلك التقنية على إدخال المادة الوراثية خارجية المنشأ (الغريبة) عن طريق الخلايا الجذعية للجنين والتي يتم استخدامها كناقل يحمل الجينات المرغوبة للأفراد المُستقبلة Recipient individuals.  

4- استخدام طريقة الليزر Use of Laser method

استخدمت هذه الطريقة لأول مرة بواسطة Kuruta وآخرون (1986)، حيث يتم إدخال المادة الوراثية (DNA) لداخل الخلية بشكل ذائب في بيئة وسيطة تُحيط بالخلايا، وتلتقط الخلايا المادة الوراثية من خلال عمل  فتحات دقيقة بجدر الخلايا، وذلك بفعل نبضات دقيقة باستخدام بؤرة أشعة الليزر. تعمل الخلايا المُعاملة بالليزر على إصلاح الفتحات التي تم عملها بجدارها الخلوي ذاتياً خلال جزء من الثانية، وبالرغم من ذلك فإن عملية التقاط المادة الوراثية تتم بنجاح. تعتمد كفاءة عملية الاندماج النووي وثباتها باستخدام هذه الطريقة على تركيز المادة الوراثية في البيئة الوسيطة.

5- استخدام طريقة القذف المجهري كناقل جيني وسيط

                    Use of Micro-projectile mediated gene transfer   

تم تطوير تلك الطريقة بواسطة Klein وآخرون (1988)، حيث تُجرى عن طريق امتصاص المادة الوراثية بواسطة حُبيبات دقيقة من مادة التنجستين  Tungsten  في وجود كلوريد الكالسيوم Calcium chloride والسبرميدين Spermidine. يتم وضع المادة الوراثية المُمتصة على السطح الأمامي لقاذف مِجهري اسطواني من مادة النايلون (البوليثين)  Cylindrical polythene micro-projectile يوضع داخل ماسورة جهاز القذف، ويتم توجيه ماسورة جهاز القذف تجاه مُعلق خلوي يوجد على قاع طبق زراعة أنسجة قياسي، وباستمرار عملية القذف يتم نفاذية المادة الوراثية إلى داخل الخلايا، ويُفيد تكرار تلك العملية زيادة كفاءة عملية النقل الجيني، ولكن تتأثر كفاءة تلك الطريقة بحجم الحُبيبات التي يتم قذفها إلى جانب سرعة عملية القذف.

6- استخدام الطرق الكيماوية Use of Chemical methods

1- الترسيب المُساعد بفوسفات الكالسيوم

                            Calcium phosphate co-precipitation

هي أحد الطرق الشائعة لإدخال المادة الوراثية DNA داخل خلايا الثدييات، حيث يحدث ترسيب للمادة الوراثية بمُعاونة فوسفات الكالسيوم على هيئة مخلوط، وإدخاله داخل الخلايا. تتضمن تلك الطريقة خلط مادة وراثية نقية   Purified DNA مع مُخففات محتوية على الفوسفات وكلوريد الكالسيوم، حيث ينتج عن ذلك تكوين راسب نقي، يتم نقله بعد ذلك إلى داخل الخلايا الجديدة المُستهدفة.

2- استخدام الديا دكستران كوسيط لنقل المادة الوراثية

                         DEAE-Dextran mediated DNA transfer

تم استخدام هذه الطريقة لأول مرة بغرض زيادة العدوى الفيروسية للخلايا، ولكنها تُستخدم الآن بعد إجراء بعض التعديلات عليها في إدماج المادة الوراثية داخل خلايا الحيوانات الثديية. يتم استخدام هذه الطريقة بكفاءة معملياً في التجارب الحيوية الخاصة بنقل الجينات، حيث تُعتبر طريقة سهلة الإجراء وذات كفاءة عالية لا ينتج عنها ثبات في الاندماج الاستيعابي.

3- استخدام البوليبرين كوسيط لنقل المادة الوراثية

                                Polybrene mediated DNA transfer        

تم استخدام هذه الطريقة في البداية بكفاءة عند إدماج الخلايا الجنينية للكتكوت مع المادة الوراثية المنسوخة لفيروسات الروز ساركوما Rous sarcoma viral DNA، والآن تُعتبر طريقة مثالية لعملية الاندماج الاستيعابي بين الخلايا الجنينية للكتكوت والمادة الوراثية لعديد من الأنواع والمصادر الجينية الأخرى. أهم ما يُميز هذه الطريقة مقارنة بطريقة الترسيب بفوسفات الكالسيوم هو ثبات عملية الاندماج الاستيعابي للمادة الوراثية بمُعدل يصل إلى 15 ضعف، كما لا تحتاج إلى حامل للمادة الوراثية لمعظمة عملية الاندماج (الاتحاد) الوراثي.