4- مراحل زراعة الأنسجة

   للوصول إلى الأهداف السابقة الذكر فإن هناك ثلاثة مراحل رئيسية للحصول على زراعة ناجحة للأنسجة وهى:

أولاً: الحصول على مزرعة معقمة Stage І : Establishment of a septic culture  

 هذه المرحلة هامة جداً وتعتبر من أهم مراحل زراعة الأنسجة والغرض منها ببساطة هو الحصول على مزرعة معقمة بمعنى عدم تلوث البيئة الغذائية المستعملة أو الأنسجة المستخدمة فى الزراعة Explants  بأى كائن دقيق يسبب تعفنها وموتها . ويأتى ذلك بتعقيم الأدوات المستعملة وتعقيم البيئة المستخدمة وكذلك تعقيم الأنسجة المستعملة والتى تكون عبارة عن أجزاء من النبات المراد إكثاره مثل القمم النامية للسيقان والجذور أو أجزاء من السيقان أو الأوراق أو نسيج الكلس ..............الخ. ثم إتمام الزراعة أيضاً فى جو وحيز معقم.

ثانياً: زيادة الأعضاء المتكاثرة  Stage П : Multiplication of propagula  

 لهدف من تلك المرحلة هو زيادة الأعضاء والتراكيب التى تعطى فى النهاية النبات الكامل لذلك تعتمد تلك الخطوة على زيادة إنتاج الأعضاء العرضية Adventitious organs  أو زيادة تكوين الأجنة أو زيادة تنشئة النموات الجانبية Axillary shoots  وعندما يكون الكلس خطوة وسطية يكون الهدف فى تلك المرحلة هو زيادة نمو الكلس ثم تخليق النموات العرضية الخضرية منها أو تكوين الأجنة الجسمية Somatic embryo  والجدول (2) يبين الطرق المختلفة لزيادة Propagula  فى هذه المرحلة Stage

 جدول (2) أهم النباتات التى نجحت بزراعة الأنسجة ومصدر المنفصل النباتى وطرق تضاعفها

 ثالثاً: الإعداد لنقل النبات للتربة Stage Ш : Preparation of re-establishment of plant  

 يمكن اعتبار أن التكاثر عن طريق زراعة الأنسجة ناجحاً إذا توج بنجاح نقل النبات الناتج فى الأنبوبة المعقمة إلى التربة واستمرار نموه وللوصول لهذه الغاية يجب العمل على أقلمة أو تقسية النباتات Hardening of plant  قبل نقلها للظروف الصعبة المحتمل أن تواجهها فى التربة مثل نقص الرطوبة Stress tolerance to moisture  خاصة إذا علمنا أن تلك الأنسجة تعتبرنامية فى وسط مائى Heterotrophic  وسوف تنتقل إلى وسط آخر Autotrophic state  . كذلك يجب استيفاء تلك النباتات لاحتياجاتها الحرارية أن وجدت لإنهاء طور الراحة كما للأبصال وللكورمات والريزومات احتياجات البرودة Chilling requirement  فيجب استيفاءه قبل نقلها للتربة .

•  احتياجات كل مرحلة Requirements of each stage :

 إحتياجات كل مرحلة تشمل احتياجات غذائية بمكونات البيئة وطبيعتها واحتياجات بيئية أى تعرض الأنسجة لدرجات حرارة وشدة إضاءة معينة. وعند دراسة المرحلة الأولى يجب ألا نغفل أن نجاح التكنيك يعتمد أساساً على حسن اختيار الجزء المنزرع Explants أما المرحلة الثانية فإن نجاحنا يتحدد بمعرفتنا إلى طريقة زيادة الأعضاء العرضية المتكونة مثل النموات العرضية والأجنة الخضرية والنموات الجانبية ..الخ. أما فى المرحلة الثالثة فيجب أن نكون ملمين بالاحتياجات الفسيولوجية للنبات المتكون كاحتياجه مثلاً لكسر طور سكونه إن كان له طور سكون أو احتياجه إلى معاملات خاصة للتقسية مثل تعريضه إلى إضاءة ذات شدة عالية High intensity light  .

وفى جدول 3 سوف نسوق ثلاث أمثلة لنباتات Bromeliads, Gerbera, Asparagus  لتوضيح احتياجات كل مرحلة من الهرمونات والاحتياجات البيئية وكذلك طبيعة البيئة الغذائية لكل لنبات .
 

 جدول (3) يوضح أهم الاحتياجات المصاحبة لكل مرحلة من مراحل زراعة الأنسجة لثلاثة من النباتات

3 - مجالات زراعة الأنسجة والخلايا

 توجد أربعة مجالات رئيسية لزراعة الأنسجة والخلايا نجملها فى المجالات التالية:

1- إنتاج بعض المواد الكيماوية العلاجية والمواد الطبيعية.

2- التحسين الوراثى للمحاصيل.

3- الحصول على سلالات خالية من الأمراض.

4- استخدام زراعة الأنسجة كوسيلة سريعة للتكاثر وإنتاج غزير من النباتات.

المادة

         اسم النبات المستخرجة منه

1- القلويدات  

- أتروبين

الأتروبا  Atropa belladonna

- أفيدرين

Ephedra Vulgaris

- لينين

Cinchona spp.

- كوكايين

نبات الكولا  Erythroxylon coca

-هيوسيامين

السكران       Hyscyamus spp.

- ستريكتين

الجوز المقئ      Strychnase sp.

- كافين

البن               Coffea Arabica

2- الجلوكسيدات

- الأميجدالين

نوى الخوخ والمشمش والبرقوق .

- السالسين

الصفصاف .

- زيت المستطردة

نباتات الفصيلة الصليبية .

3 - الزيوت العطرية

عديد من النباتات

4- الفيتامينات

عديد من النباتات

 ثانياً: التحسين الوراثى للمحاصيل The genetic improvement of crops  :

        يخدم تكنيك زراعة الأنسجة والأعضاء والخلايا مربى النبات فى مجالات مختلفة نجمعها فى الآتى:

 أن البحث عن التراكيب الوراثية أو مصادر الاختلافات الوراثية وإنتاج أصناف جديدة لهو الشغل الشاغل لمربى النبات وهو فى صدد هذا الهدف قد يواجه بعدة عقبات يمكن تزليلها بتكنيك زراعة الأنسجة والأعضاء.

1- ثبت أن الأجنة الناتجة من الهجن المتباعدة الآباء لا يتم تكوينها ونضجها مثل الأجنة الناتجة عن الهجن الجنسية والنوعية، تلك الأجنة تعانى من ظاهرة تعرف بظاهرة العقم الأندوسبيرمى Somatoplastic sterility  وتنتج من عدم التوازن الكروموسومى لأنسجة الإندوسبرم والجنين فكما هو معروف أن الأجنة لا تتصل مباشرة بالأنسجة الوعائية لنبات الأم ولكن يتم الاتصال عن طريق الإندوسبرم والذى يستقبل المواد الغذائية ثم يقوم بتوصيلها للجنين عن طريق الحيل السرى . وبالفحص السيتولوجى لمثل تلك الأجنة الهجينة ثبت أن الزيجوت ينقسم عدة انقسامات أولية كالمعتاد ثم يتكون فى قاعدة البويضة أى بين الحبل السرى والطرف الكلازى منطقة بها خلايا غير حية تمنع من وصول الغذاء للأندوسبرم وعندئذ يموت نسيج الإندوسبرم والذى يعقبه موت الجنين فإذا أمكن عزل الأجنة الجنسية فى وقت مناسب وتنميتها على بيئة مناسبة فإنه يمكننا الحصول على تلك الأجنة فيما يعرف بزراعة الاجنة  Embryo culture   وهو هدف عظيم لمربى النبات .

2- عند سعى مربى النبات فى الحصول على قوة الهجين يواجه بعدة مشاكل أهمها طول القترة بين الأجيال والتى تطيل من برامجه فضلاً على صعوبة الحصول على نباتات متماثلة فى صفاتها الوراثية Homozyous  لذلك يتطلب منه تأصيل العوامل الوراثية بالتربية الذاتية أو التهجين الذاتى لعدة أجيال فيواجه بأن نباتات الجيل الثالث أوالرابع تكون عديمة الخصوبة مما يوقف من برامجه لذلك فإن حصوله على نبات أحادى المجموعة الكروموسومية Haploid  يعتبر من الآمال العظيمة لمربى النبات حيث يمكنه مضاعفتها بالكولشيسين فيحصل على نبات ثنائى المجموعة الكروموسومية وفى نفس الوقت أصيل فى عوامله الوراثية Homozygous   وذلك باستخدام مجال زراعة الأنسجة بزراعة المتك أو حبة اللقاح لإنتاج نبات أحادى المجموعة الكروموسومية وفى وقت قصير جداً بالمقارنة بالطريقة التقليدية .

3- من أهم طرق التربية هو البحث عن تراكيب وراثية عن طريق الانتخاب لذلك تصعب تلك المهمة على مربى النبات إذا تضاءلت أمامه وجود مصادر الاختلافات الوراثية أما إن توافرت فيكون أمامه مهمة صعبة وهى عمل Screening  لعدد كبير من النباتات وهى مهمة ولكن باستخدام تكنيك زراعة الأنسجة ومعلقات الخلايا يمكن لمربى النبات معملياً أن يتعامل مع عشيرة كبيرة جداً فى  فى طبق بترى فيسهل عليه مهمة الانتخاب إذ أن الانتخاب سوف يجرى على مستوى الخلية وليس على مستوى النبات الكامل وفى هذا المجال يمكن لمربى النبات أن ينتخب لصفات عديدة مقل مقاومة الأمراض ، مقاومة الملوحة ، مقاومة سُمية المبيدات ، مقاومة النيماتودا ، مقاومة الجفاف .. الخ. ويتم ذلك بالحصول على مزارع للخلايا ثم تعامل بسموم الفطر المسبب للمرض أو بتركيزات عالية من الملح أو بتركيزات مختلفة للمبيد ثم تنتخب الخلايا التى تقاوم الصفة المرغوبة فتنتقل إلى بيئة غذائية لتكوين الكلس ثم يوجه الكلس نحو تخليق الأعضاء الخضرية والجذرية وبذلك يمكن الحصول على نبات كامل كما يمكن بنفس التكنيك استحداث الطفرات وعزلها .

4- قد يصعب على مربى النبات إجراء التهجينات الجنسية والنوعية عند الرغبة فى نقل صفة ما من نبات إلى آخر لكن عن طريق التكنيك الجديد وهو ما يعرف بتكنيك الهندسة الوراثية وزراعة البروتوبلاست يمكن إجراء تلك التهجينات فضلاً على إمكانية عزل جين بمفرده ونقله ليدمج مع المادة الوراثية لنبات مراد إدخال صفة ما فيه بالإضافة إلى إمكان نقل أى مادة وراثية معزولة من أى كائن حى إلى النبات وقد كان وذلك بالطبع مستحيل باستخدام الطرق التقليدية.

2 - مصطلحات زراعة الأنسجة  Plant tissue culture terminology

Adventitious: هى أعضاء نباتية ( براعم ، نموات خضرية ، جذور ...إلخ ) نتجت بطريقة عرضية فى موضع غير تقليدى أو فى وقت غير تقليدى مثل تكون النموات الخضرية على نسيج الكلس أو تكون الأجنة العرضية من الكلس بدون مبيض أو عمليات تزاوج وإخصاب.

Aseptic :  هو الخلو من الكائنات الممرضة والتلوث بالفطريات والبكتيريا والفيرس ...إلخ أى خلو البيئة الغذائية من الكائنات الدقيقة وهو متطلب هام أساسى لمزارع الأنسجة النباتية.

Axillary bud :  برعم أو فرع خضرى إبطى يخرج من إباط الأوراق وهو عادة يتكون من الخلايا المرستيمية الإبطه للقمم النامية وعادة تدفع لإنتاج أعداد كبيرة Mass production  ويتم ذلك خلال استخدام الهرمونات التى تعمل على تثبيط السيادة القمية للقمة النامية وتشجيع إنتاج Lateral shoot  .

Bud : هو البرعم الخضرى أو الزهرى وهو مازال فى حالة نشأة ولم ينمو بعد Unemerged  وعادة ما يكون مغلق بعدة أوراق حرشفية تسمى Bud scale  .

Calluses, Calli, Callus : هى أنسجة الجروح التى تتكون عند السطح المجروحة فى النبات وهى أنسجة غير متميزة Disorganized tumor-like masses  وهى أنسجة برانشيمية تختلف فى درجة تلجننها وعادة لا يوجد بينها مادة لاحمة الميدلاميلا .

Cybrid  : هى الخلية أو النبات الناتج من التهجين السيتوبلازمى مع نواة إحدى الخلايا وعضوات الخلية السيتوبلازمية من أخرى .

Differentiation : التميز أو التخلق أو هى التغيرات الفسيولوجية الحادثة فى خلايا الأنسجة أو الأعضاء أثناء التطور والنمو لتصبح الخلايا أو الأنسجة متخصصة ولها دور فسيولوجى وعمل معين .

Organogenenesis : هى نشأة الأعضاء على سطح المنفصل النباتى أو من الكلس الناتج من زراعته وهى عادة تكون إما نموات خضرية أو جذور .

Disease – free, Pathogen – free, Virus – free, Pathogen – tested : هى النباتات الخالية من أى أعراض مرضية واختبرت فى احتواءها على المسبات المرضية فكانت النتائج سلبية وتستخدم مثل تلك النباتات كمصدر للحصول على نباتات ذات مواصفات مثالية .

Embryoid or Somatic embryo  : الأجنة العرضية وهى تشبه مورفولوجياً الزيجوتية وهو ينشأ من أنسجة خضرية تنتج In vitro  .

Embryogenesis : هى عملية تكوين الأجنة بطريقة غير جنسية وعادة تنمو الأجنة اللاجنسية مباشرة من زراعةExplant  أو بطريقة غير مباشرة من الكلس وفى بعض الحالات العرضية من الخلايا المنفردة .

Excise : هو عزل أو فصل أنسجة أو أعضاء أو قطاعات الأنسجة من النبات كأجزاء نباتية للزراعة بطريقة جراحية مثل عزل القمة النامية تحت الميكروسكوب وزراعتها In vitro .

In vitro : (هى كلمة لاتينية تعنىIn glass )  وتعنى التجارب العملية على الأعضاء النباتية والتى فى الأوعية الزجاجية Glassware  والتى تنمو تحت ظروف صناعية Artificial Conditions  لزراعة الأنسجة .

In vivo : (وهى كلمة لاتينية تعنى In life  ) وهى التجارب العملية على الأعضاء النباتية تحت الظروف الطبيعية وهى مرتبطة بأجزاء النبات الأخرى الحية .

Induction : وهى الحث أو التغيرات الفسيولوجية التى تعمل على حدوث ظاهرة فسيولوجية أثناء عمليات التطور والتى ينتج عنه عملية Initiation  .

Initiation : هو أول تغير ميكروسكوبى مرئى لتميز الخلايا وتخليقها عند تطورها إلى أعضاء .

Meristem : هى مناطق النمو والانقسام وتكوين وبناء البروتوبلاست ومنشأ الأنسجة الجديدة فى النباتات وعادة تكون الخلايا المرستيمية خلايا غير متميزة Undifferentiated  منها تتكون الأنسجة المتخصصة وظيفياً أو فسيولوجية وتوجد فى القمم النامية للأفرع الخضرية أو قمم الجذور وفى أباط الأوراق وخلايا الكمبيوم الحزمى وأماكن النمو الأخرى مثل الأوراق الحديثة ...إلخ .

 Meristemaid: كتلة أو خلايا عنقودية ، من خلايا مرستيمية لها القدرة على النمو والتطور تحتوى على سيتوبلازم كثيف مع عديد من الفجوات العصارية.

Shoot apex or Shoot tip  : هى القمة المرستيمية الهرمية أو قبية الشكل Meristematic dome  والأوراق المنبسقة Emerging leaves  وبعض من خلايا الاستطالة الساقية ويجب عدم الخلط بين مصطلح Meristem tip , shoot tip  فالأخير أصغر حجماً ويحتوى على القبة المرستيمية فقط أو زوج واحد من مبادئ خروج الأوراق .

Somatic Hybrid  : الهجن الجسيمة وهى الناتجة من دمج الخلايا أو البروتوبلاست لتكوين Genom  جديد .

Subculture  : هى إعادة الزراعة من زراعة أخرى بنقل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء المتكونة على بيئة جديدة وذلك بعد مرور زمن فاصل يسمى Passage time  وفى الغالب تكون البيئة الجديدة لها تركيب مختلف فى واحد أو أكثر من مكونات البيئة للحصول على شكل مورفولوجى جديد أو تطور للأعضاء وكثيراً ما يخلط البعض بين مصطلح Subculture – Reculture  الأخير يستخدم فى نقل الأنسجة أو الأعضاء على بيئة غذائية طازجة لها نفس المكونات للبيئة السابقة ويكون الغرض هنا المحافظة على النسيج من التدهور نظراً لجفاف البيئة أو إنقاذ محتوياتها أو تغير درجة حموضتها أو صلاحيتها ولكن تظل الأنسجة فى نفس المرحلة من التطور .

1- مقدمة تاريخية

-   أول من تنبه إلى قدرة الخالق سبحانه وتعالى فى أن كل خلية نباتية منفردة لها القدرة على التكاثر وتكوين نبات كامل والتى عرفت حينئذ بالقدرة الذاتية والتى اعتمد عليها علم زراعة الأنسجة النباتية هو Haberlandt وكانت أول محاولة له عندئذ سنة 1902 ولكنها لم تكلل بالنجاح ولم يفسر فى ذلك الوقت سبب فشله على نحو محدد ولكن عرف فيما بعد أن البيئة الغذائية التى استعملها لم تكن تحتوى على الهرمونات النباتية التى لم يكن معروف دورها الأساسى فى تنظيم انقسام واستطالة الخلايا وكذلك تميزها وتخليقها أى كل ظواهر التكشف المورفولوجى.

-   وقد مارس الفسيولوجيين فكرة زراعة الأنسجة النباتية منذ ذلك الحين باعتبارها طريقة ذات قيمة كبيرة بدراسة بعض الظواهر الخاصة بالنمو والأيض وقد بدأت الدراسات الجادة على زراعة الأنسجة والخلايا والأعضاء منذ زمن يقدر بسبعين عاماً تقريباً حينما تمكن العالم White فى عام 1934 من تركيب واستنباط بيئة غذائية تمكن من إنماء جذور الطماطم عليها.

-   ثم اكُتشف فى نفس العام 1934 أول الهرمونات النباتية وهى الفيتواوكسين (IAA) 3 indol acetic acid  بواسطة كلا من Kagl and Haagen &smith and Erxleben .

-   استخدم Guatheret  عام 1939 الأكسين لأول مرة بإضافته للبيئة الغذائية وبذلك تمكن من إنتاج نسيج الكلس من زراعة أنسجة نخاع الجزر وفى نفس العام تمكن Whit 1939  من إنتاج الكلس من نبات الدخان.

-   اكتشف Van Overbeek and Blakeslee  فى عام 1941 أهمية لبن جوز الهند " الإندوسبرم السائل لثمار جوز الهند الغير ناضجة " Coconut Milk  فى تشجيعها على إنتاج الكلس عند زراعة أجنة الداتورة . عندئذ تمكن عند الجمع بين الأكسين ولبن جوز الهند من انتاج الكلس فى عديد من النباتات.

-   ثم جاءت مجهودات معمل Skoog فى عام 1948 مكللة بالنجاح لتكتشف الكينتين والنى استخدمت مع الأكسين لتكوين الأعضاء المختلفة أو ما يسمى بالتكشف الموفولوجى.

-   فى عام 1949 تمكن Nitsch  من زراعة مبيض الطماطم لإنتاج نبات كامل .

-   فى عام 1952 تمكن Morel and Morting من الحصول على أول نبات خالى من الفيرس باستخدام تكنيك زراعة الأنسجة من نبات الدليا.

-   فى عام 1956 تمكن Nickell لأول مرة من زراعة معلقات الخلايا لنبات الفول.

-   اكتشف Skoog and Miller عام 1957 أن التوازن الهرمونى بين الأكسين والسيتوكينين هو المسبب لاختلاف التخليق المورفولوجى لأنسجة الدخان والتى ينتج عنها الكلس أو النموات الخضرية أو الجذور العرضية.

-   أمكن لأول مرة تخليق الأجنة العرضية من زراعة خلايا الجزر بواسطة Reinert and Steward وذلك فى عام 1958.

-   تمكن Cocking عام 1960 من عزل بروتوبلاست الطماطم لأول مرة بعد معاملتها إنزيمياً.

-   فى عام 1962 من دراسة لـMurashige and Skoog  تم تطوير البيئة الغذائية اللازمة لتنمية كلس الدخان وثبت فيما بعد صلاحيتها لعديد بل معظم النباتات .

-   تمكن Baurgin and Nitsch عام 1967 من الحصول على أول نبات أحادى المجموعة الكروموسومية من زراعة متوك نبات الدخان.

-   قام Murashige ومساعدوه فى عام 1972 من تطوير تكنيك التطعيم الدقيق للقمم النامية Shoot-apex-micrografting للحصول على نباتات خالية من الفيرس فى الموالح.

-   فى عام 1977 تمكن Chilton ومساعدوه من عزل البلازميد من البكتريا لاستخدامها فى إدخال مادة الجين إلى نبات آخر وكان ذلك مدخلاً لما عرف فيما بعد باسم الهندسة الوراثية.

-   بعد عام من ذلك أمكن عزل البروتوبلاست من كلا من الطماطم والبطاطس وإحداث التهجين الخلوى بينهما بدمج البروتوبلاست Protoplast fusion وذلك بواسطة كل من Melchers Halder & Sasrristen  عام 1978 .

-   فى عام 1978 أمكن إنجاز عمل ضخم هو اكتشاف وعزل وتوصيف الإنزيمات الإندونيوكليز المقيدة Restriction enzymes  وأطلق عليها هذا لأنها لا تقطع DNA  عشوائياً ولكنها تقطعه فى أماكن محددة . وهذا الاكتشاف هو بحق أهم كشف لإمكان عزل الجينات ونقلها وتحقيق أهداف الهندسة الوراثية وقد نال كل من Nathans and Smith  عن هذا العمل جائزة نوبل فى العلوم .