تعريف :
يقصد بالبروتين الخام البروتين الحقيقي والمواد النيتروجينية الغير بروتينية ( البروتين الغير حقيقي ) مثل أملاح الامونيوم واليوريا والأحماض الامينية الحرة والببتيدات .
فكرت التقدير :
هناك عدة طرق لتقدير البروتين الخام إلا أن أوسع الطرق انتشارا هي طريقة كلداهل والفكرة الأساسية بها هضم المواد الغذائية بها بحامض الكبريتيك المركز الذي يحولها إلي CO2 و O2 وH الذي يتأكسد جزء منه بواسطة الأكسجين ويتحول إلي ماء , أما الازوت فيتحول مع الجزء الباقي من الإيدروجين إلي امونيا وهذه تتفاعل مع حامض الكبريتيك مكونتا كبريتات امونيوم , وبطبيعة الحال فان جميع المواد الغير عضوية الموجودة في المادة الغذائية تتحول إلي أملاح كبريتات . بعد عملية الهضم تقطر كبريتات الامونيوم الناتجة مع إضافة زيادة من محلول الصودا الكاوية 40 % أي كمية كافية لمعادلة حامض الكبريتيك المركز المضاف سابقا وتتحول كبريتات الامونيوم عند التسخين إلي امونيا فتتصاعد وتستقبل في قابلة تحتوي علي كمية معلومة من حامض الكبريتيك المخفف الذي يتفاعل جزء منه معها مكونا كبريتات امونيوم . والجزء الذائب من الحامض يمكن معادلتة بمحلول صودا كاوية مخفف وبذلك نستطيع معرفة الكمية من حامض الكبريتيك المخفف التي تعادلت مع الامونيا المنفردة من المادة الغذائية .
بعض العوامل المساعدة التي تستخدم عند تقدير البروتين الخام :
تحتاج عملية الهضم إلي عامل مساعد للإسراع في إكمالها علي الوجة الأكمل وتستعمل عدة مواد أهمها :
1- كبريتات النحاس وهي تستعمل بكثرة ولكن عيبها الوحيد إذا استعملت بتركيز عالي فأنها تتحد مع الامونيا الناتجة مكونة معقد يصعب تحللة (كبريتات امونيوم) .
2- الزئبق من أحسن المواد خاصتا لو استعمل مع كبريتات النحاس وهو أيضا يتحد مع الامونيا مكونا معقدات لذلك عند استعماله في الهضم يضاف بعد عملية الهضم ثيو كبريتات الامونيوم لتكسير المعقدات .
3- السلينيم يعتبر أحسن العوامل المساعدة لو استعمل بنسب مضبوطة مع كبريتات النحاس وله عيب واحد أنة إذا طالت مدة الهضم يؤدي إلي فقد الامونيا في صورة نيتروجين .
4- مخلوط الهضم وهو مخلوط من كبريتات نحاس و كبريتات بوتاسيوم نبسبة 1 : 4 ويضاف 0.57 جرام أكسيد سيلينم أو 1.8 سيلينات صوديوم لكل 400 جرام من هذا المخلوط .
فائدة كبريتات البوتاسيوم :
بطبيعة الحال فان كبريتات النحاس وأكسيد السيلينيم هي العوامل المساعدة الموجودة في المخلوط أما كبريتات البوتاسيوم ففائدتها رفع درجة غليان التفاعل وهذا من شأنة الإسراع من عمليات الهضم .
عيوب طريقة كلداهل :
تعتبر طريقة كلداهل طريقة أساسية تقارن بها الطرق الاخري إلا أنها لا تخلو من العيوب وأهمها :
1- أن حساب البروتين علي أنة النيتروجين مضروبا في 6.25 فية خطا قد يكون كبير في بعض الأحيان فالمواد الغذائية تحتوي علي مواد ازوتية غير بروتينية مثل الامونيا والأحماض الامنية قد تحتوي علي 80 % نيتروجين وبهذا قد يختل تقدير البروتين بطريقة كلداهل لمثل هذه المواد .
2- البروتينات المختلفة لا تحتوي علي 16 نيتروجين بل تختلف النسبة اختلافا كبيرا في أنواع البروتينات المختلفة فالبروتين الحيواني يحتوي علي 16.67 % نيتروجين والكازين يحتوي علي 15 % نيتروجين أما البروتينات النباتية فقد تحتوي علي 16.4 إلي 18.7 % نيتروجين وحتى البروتين الواحد تختلف نسبة البروتين فية ففي الكازين تختلف النسبة من 14.7 إلي 16.04 % علي حسب تصحيح التقدير بالنسبة للرطوبة أو الرماد .
3- يعتري تقدير البروتين الكلي بطريقة كلداهل صعوبات جوهرية أهمها تحديد أحسن العوامل المساعدة وبأفضل النسب وأفضل مده للهضم بحيث لا تؤدي إلي أخطا ء كبيرة .
المحاليل المطلوبة :
1- حامض كبرتيك مركز 37ع.
2- مخلوط هضم
3- محلول صودا كاوية 40 %
4- محلول حامض كبرتيك مخفف 0.1ع
5- محلول صودا كاوية مخفف 0.1ع
خطوات العمل :
تنقسم عملية تقدير البروتين بطريقة كلداهل إلي طريقتين(ماكرو كلداهل – ميكروكلداهل ) حسب نوع العينة وتنقسم كل طريقة إلي 3 مراحل هي علي الترتيب الهضم – التقطير ( وحدة الهضم أو وحدة المار كهام ) – المعايرة .
|
وجة المقارنة |
ماكرو كلداهل |
ميكروكلداهل |
|
1- نوع العينة |
العينات الصلبة مثل ( عينات العلف التي تحتوي علي نسبة عالية من البروتين ) |
العينات السائلة مثل ( اللبن – البول – الدم – المحاليل البيولوجية الاخري ) أو العينات التي لا يزيد محتواه من البروتين عن 0.2 – 0.8 % |
|
2- وزن العينة
|
0.5 جرام |
0.1 جرام أو 0.2 مل محلول |
|
3- مرحلة الهضم |
20مل حامض H2SO4 مركز + 5 جرام مخلوط هضم |
2 مل حامض H2SO4 مركز +0.5 جرام مخلوط هضم |
|
4- مرحلة التقطير |
70-90 مل صودا كاوية 40 % تضاف إلى العينة بوحدة التقطير و 20 مل H2SO4 مخفف 0.1ع و 3 نقطه من دليل MR في دورق الاستقبال |
7مل صودا كاوية 50 % تضاف إلى العينة بوحدة التقطير و 20 مل دليل حمض البوريك في دورق الاستقبال |
|
5- مرحلة المعايرة |
تعاير الزيادة من الحامض باستخدام صودا كاوية 0.1ع |
تعاير الامونيا باستخدام H2SO4 0.1ع |
|
6- نقطة نهاية التفاعل |
زوال اللون الوردي |
الوصول إلى اللون البنفسجي |
|
7- خطوات الحساب |
ملي مكافئات الحامض الكلية = 20× 0.1 =2 ملي مكافئ ملي مكافئات الحامض المتفاعلة = ملي مكافئات الحامض الكلية - ملي مكافئات الحامض الزيادة ملي مكافئات الحامض الزيادة = ملي مكافئات القاعدة = القراءة × العيارية الفعلية للقاعدة % للبروتين =( ملي مكافئات الحامض المتفاعلة × 0.014 × 6.25) / وزن العينة × 100 |
% للبروتين =( القراءة × العيارية × 0.014 × 6.25) / وزن العينة × 100 |
ملحوظة :
1- يتكون محلول دليل حمض البوريك من 20 مجم من MR و 60 مجم من دليل أخضر البرومو كريز ول مذابة في 100 مل كحول إثيلى و 40 جم من بلورات حمض البوريك مذابة في 400 مل ماء مقطر ثم يكمل الحجم النهائي إلى 2 لتر بواسطة الكحول الإثيلى.
2- كل واحد ملى من حمض الكبريتك يزن 0.014 جم نيتروجين . على أساس أن كل 1000 ملى مكافئ من حمض الكبريتيك = ذرة واحدة من النيتروجين أي 14 جم نيتروجين .
3- كيفية تحضير كلا من :
أ- H2SO4 0.1 ع
مثال :
لتحضير 1 لتر H2SO4 0.1 ع
الوزن الجزائي الجرامى 98 جم ( 2+32+16 × 4 )
تكافئ الحمض ثنائي إذا الوزن المكافئ له = 98 /2 = 49 وهذا لتحضير H2SO4 1 ع
ولذي لتحضير H2SO4 0.1 ع لابد من القسمة على 10 أي أن الوزن لابد أن يكون 4.9 ولكن الحامض في صورة سائلة إذا لابد من تحويل الوزن إلى حجم عن طريق العلاقة بين الكثافة والكتلة والحجم .
حجم الحامض الواجب إستخدامة = 4.9/1.84 = 2.66 مل اى يؤخذ 2.66 مل حمض H2SO4 Con ويكمل الحجم إلى لتر باستخدام الماء المقطر.
ب- NaOH 0.1 ع
مثال :
لتحضير 1 لتر NaOH 0.1 ع
الوزن الجزائي الجرامى 40جم ( 1+16+23 )
تكافئ الصودا أحادى إذا الوزن المكافئ له = 40 /1 = 40 وهذا لتحضير NaOH 1 ع
ولذي لتحضير NaOH 0.1 ع لابد من القسمة على 10 أي أن الوزن لابد أن يكون 4 جم تذاب فى لتر ماء مقطر.
ج- NaOH 50 %
لتحضير 1 لتر NaOH 50 %
أي أن كل 100 مل من المحلول بها 50 جم NaOH
إذا كل 1000 مل من المحلول بها 500 جم NaOH
أي يؤخذ 500 NaOH وتذاب في لتر ماء مقطر.
