الهدف :
فحص معايرة الأجسام المضادة , للأجسام المضادة الخاصة (OVA) زلال بويضة الدجاجة باستعمال طريقة اليسا ELISA
المواد المطلوبة لطلاء الآبار بمولد الضد :-
1- طبق يحتوي على 96 بئر بلاستيكي .
2- محاليل مولد الضد :-
أ. محلول (OVA) تركيز 50 ملغم /مل , مخفف ب (PBS)
ب. محلول (BSA) تركيز 50 ملغم/مل , مخفف ب (PBS)
3- محلول الاعتراض :1% BSA , مذاب ب (PBS) .
4- محلول الغسل : (PBS)
· المواد المطلوبة لعمل التخفيف المتسلسل للأجسام المضادة الأولية ولربط الأجسام المضادة الثانوية .
1- طبق يحتوي على 96 بئر مطلي بمولد الضد (BSA) & (OVA)
2- ماصة مخبرية 50-200 ميكرو ليتر مع رؤوسها الخاصة يفضل استخدام الماصة المخبرية متعددة القنوات .
3- محلول الغسل : (PBS)
4- 0.3مل من مصل أرنب تم إكسابه مناعة ضد زلال بويضة الدجاجة (OVA) مخفف بنسمة 100:1 في PBS, كمعيار ايجابي.
5- 0.3 مل من مصل أرنب لم يتم إكسابه مناعة ضد زلال بويضة لدجاجة مخفف بنسبة 100:1 في PBS كمعيار سلبي .
6- 30 مل من محلول منظم للتخفيف : 0.5 % BSA مذاب في PBS .
7- 15 مل من محلول ( أجسام مضادة ثانوية ) : أجسام مضادة مأخوذة من ماعز مضادة للفئران مربوطة بأنزيم البروكسيداز ، الأجسام المضادة يجب إن تكون نسبة التركيز فيها 2000:1 مخففة ب PBS.
8- 15 مل من محلول منظم للمادة المتفاعلة .
الطريقة :-
طلاء الآبار بمولد الضد .
12- قم بإضافة 100 ميكروليتر من محلول مولد الضد لل (OVA) في الصفوف من 1 إلى 4 ومن 9 إلى 12 .
13- اترك الآبار لمدة ساعتين بدرجة حرارة الغرفة أو لمدة 12 ساعة على درجة حرارة 4 درجات مئوية .
14- قم بإفراغ السائل الموجود بالآبار بقلب الطبق على وعاء فارغ .
15- اغسل الآبار باستعمال محلول منظم PBS ثم افرغ عليه السائل في وعاء فارغ .
16- كرر عملية الغسل 3 مرات .
17- ضع الطبق موجه وجهه إلى ورق التنشيف . ثم قم بضرب الطبق بلطف على ورق التنشيف عدة مرات حتى تزيل ما تبقى من السائل .
18- قم بإضافة 100 ميكروليتر من محلول الاعتراض ( 1% BSA مذاب في PBS (إلى كل بئر في الطبق(حتى في الصفوف 5 إلى 8) واتركها في درجة حرارة 4 مئوية لمدة 12 ساعة , ثم قم بغسل الطبق كما هو مشروح في الخطوات من 3-5 .
19- احفظ الطبق على حرارة 4 مئوية حتى الخطوات التالية .
· إضافة التخفيف المتسلسل للأجسام المضادة الأولية .
20- افرغ محتويات الآبار وقم بالغسل كما هو موضح بالخطوات من 3-5 .
21- جفف الآبار كما هو موضح في الخطوة 6 .
22- أضف 180 ميكروليتر من محلول التخفيف إلى كل بئر في الصفوف (A12 – A1) و 100 ميكروليتر من محلول التخفيف إلى بقية الآبار ( إلى الصفوف B إلى H) انظر الشكل 2.9 .
23- أضف 20 ميكرو ليتر من مصل الأرنب الذي تم إكسابه مناعة ضد زلال بويضة الدجاج ( OVA) )إلى ستة أبار في صف ׂ(A10,A9,A6,A5,A2,A1)A , امزج جيدا ثم انقل 100 ميكروليتر إلى البئر الذ يليه حسب الترتيب:
A1--àB1 ,A2-----à B2 , A5---à B5 , A6----à B6 , A9--à B9 ,
A10--- àB10
أكمل عمل التخفيف المتسلسل إلى صف ( H10,H9, H6,H5,H2,H1 )H. ثم خذ من البئر 100 ميكرو ليتر وتخلص من هذه الكمية .
24- قم بتغير رؤوس الماصة المخبرية ثم أضف 100 ميكروليتر من مصل الأرنب الغير مكسب مناعيا إلى الآبار A3,A4,A7,A8,A11,A12 في الآبار G3,G4,G11,G12,H3,H4,H11,H12 ، قم باضافه 100 ميكروليتر من PBS مكان المصل المجفف
25 – غطي الطبق بالبارافيلم ، واتركه لمدة ساعة على درجة حرارة الغرفة .
* ارتباط الأجسام المضادة الثانوية :-
26- افرغ السائل من الآبار ثم قم بغسل الآبار ثلاث مرات بمحلول الغسيل كما هو موضح بالخطوات من 3-5 .
27- أضف 100 ميكروليتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى جميع الآبار .
28- غطي الطبق بالبارافيلم احفظه لمدة ساعة على درجة حرارة الغرفة .
29- أفرغ السائل من الآبار ثم قم بغسيل جميع الآبار ثلاث مرات كما هو موضح بالخطوات من 3-5 .
بداية التفاعل اللوني :-
30- أضف 100 ميكروليتر من محلول المادة المتفاعلة إلى جميع الآبار .
31- ضع الطبق في مكان معتم لفترة 30 دقيقة .
32- اخرج الطبق من المكان المعتم ولاحظ التغير في اللون .
33- درج شدة اللون من 1الى 5 بحيث يكون 5 اشد لون ( غامق ).
اسئلة حول الموضوع:-
1- في رأيك , أي طريقة يمكن استخدامها لتدريج شدة اللون بالاعتماد على محاليل مخففة من المصل ؟
2- ارسم رسما بيانيا يبين اعتماد شدة اللون على تركيز الأجسام المضادة ؟
3- ما هو الهدف من استخدام مصل الأرنب الغير مكسب مناعيا ؟ انظر إلى الشكل 2.9 , الاعتماد (3,و4.11.12) .
4- قارن نتائج الأعمدة 1و 2 مع نتائج الأعمدة 3و4 ثم قارن الأعمدة 9 و 10 مع الأعمدة 11و 12 .
5- أي وسيط ممكن إن نغيره للحصول على شدة لون أعلى للتفاعل ؟
6- هل كان هناك معيار أجسام مضادة ايجابي في مصل الأرنب الغير مكسب مناعيا ؟ إذا كان هنالك , كيف تفسر ذلك ؟
7- شدة اللون تعتمد على تركيز الأجسام المضادة الأولية أو على الأجسام المضادة الثانوية ؟
