تشخيص المرض النباتى  Plant Disease Diagnosis

* مـقـــــدمــة :

تشخيص المرض هو علم ومهارة التعرف علي وجود مرض وذلك بناء علي الحس الدقيق والإدراك الواعي لأعراضه وخصائصه ، ومن ثم التعرف على المرض والممرض.

من التعريف السابق يتضح أن القائم بعمليه التشخيص لابد أن يقترن لديه العلم والمهارة فالعلم هو ما نستقيه من معلومات عن الأمراض النباتية ومسبباتها والعوامل المؤثره عليها , أما المهارة فتتمثل فى القدرة على الملاحظة الجيدة والقدرة على الخروج بالاستنتاجات الصحيحة وهى تكتسب من تراكم الخبرات في تشخيص الأمراض النباتية لمحصول ما أو مجموعة معينه من المحاصيل بحيث تكون مألوفة لدي المشخص , ليس هذا فقط بل يجب أن يكون للمشخص خبره عمليه بالمحصول نفسه وطبيعة نموه في الحقل تحت الظروف العادية حتى يستطيع أن يدرك أي  انحراف يحدث عن النمو الطبيعي للمحصول.

وعموما برنامج تشخيص المرض النباتى يعتمد على الاتى:

1. البيانات التى تجمع عن الحالة فى الحقل من المزارع.   

2. التشخيص فى حقل المشكلة.  

3. التشخيص فى المعمل.

 حيث أنه هناك أمراض يمكن أن يتعرف عليها ذوي الدراسة المحدودة في أمراض النبات بسهولة بل أن المزارع نفسه يمكن أن يتعرف عليها إذا كانت شائعة الحدوث علي المحصول مثل أمراض ألأصداء والتفحمات والبياض الدقيقى ...... وغيرها , بينما قد تظهر في بعض الأحيان مشكلات يتطلب التعرف عليها الاستعانة بمشخص علي درجه مناسبة من الخبرة , وقد يتطلب أجراء بعض التجارب فى المعمل للتعرف عليها.

* أهمية تشخيص المرض :

عملية تشخيص المرض النباتى تماثل تماما الكشف عند الطبيب بالنسبة للانسان حيث أنها هي الأساس الذي يعتمد عليه مكافحة المرض , وعلي ذلك فإن دقة التشخيص وسرعته أيضا يكون لهما بالغ الأثر في محاصرة الحالة ومنع أو تقليل الخسارة الإقتصادية , علي العكس من ذلك فإن التشخيص الخاطئ سيؤدي إلى عدم فعالية الإجراءات المتخذة وهذا يعني تفاقم المشكلة من ناحية وإلى مزيد من الخسائر من ناحية أخرى. فلو افترضنا على سبيل المثال أن المشخص يقوم بتشخيص أحد ألامراض وكان هذا المرض متسبب عن فطر مثلا إلا أن المشخص أخطأ وقام بتشخيصه على أنه متسبب عن بكتيريا وعلى هذا الأساس أعطى توصية بإجراء أحد المعاملات المستخدمة فى مكافحة البكتريا , ففى هذه الحالة سيلاحظ بمرور الوقت أن شدة الإصابة تزداد ، وأن المزارع تكبد نفقات مكافحة لا طائل منها وأن  الضرر الواقع على النبات قد ازداد وربما أصبحت السيطرة على الحالة أكثر صعوبة.

أولا: تشخيص المرض في الحقل:

تشخيص المرض في الحقل يعتمد بالدرجة الأولي علي الإدراك الواعي للأعراض والعلامات المرضية , كما أنة يعتمد علي الكثير من المشاهدات التي يلمسها المشخص بنفسه والمعلومات التي يمكن أن يستقيها من صاحب حقل المشكلة كما أن الطبيب يذهب إلى مريضة حاملا حقيبة وبها ما يستعين به علي تشخيص المرض فإن مشخص المرض النباتي أيضا يصطحب معه حقيبته وبها أدوات يستعين بها علي أداء مهمته والحد الأدنى من الأدوات هو:

1- آلة التصوير ، على أن تكون من نوع جيد ويمكنها تقريب الصور.

2- عدسة يدوية لفحص الأعراض والعلامات بدقه.

3- مديه صغيرة لشق النبات إذا تطلب البحث عن علامات داخليه.

4- مقص تقليم لقص أفرع الأشجار وفحصها بدقه أو أخذ عينة منها.

5- شقرف صغير لإزالة التربة حول الجذر واقتلاعها لفحصها.

6- أكياس ورقية وأخرى من البولي إثيلين لأخذ عينات نباتية أو عينات من التربة إلى المعمل إذا لزم الأمر.

7- بطاقات تدوين بيانات وأقلام للكتابة على أكياس البولى إيثيلين.

8- بطاقات بيانات تشخيص مرض لجمع كافة البيانات التي يستعين بها في التشخيص.

* خطوات التشخيص الحقلى:

عند وصول المشخص إلى حقل المشكلة فإنه يقوم بأداء مهمته تبعا للترتيب التالي:

أ- ملاحظة توزيع المرض في الحقل:

تؤدي طريقة توزيع المرض في الحقل إلى ترجيح الاحتمال تجاه ممرض ما أو مجموعة معينة من الممرضات ومن الأمثلة على ذلك:

1- ظهور أعراض بطريقة عشوائية علي نباتات بالحقل يعنى أن الحالة راجعة إلى أحد الفطريات المحمولة بالهواء.

2- ظهور أعراض علي جميع نباتات الحقل معناه أن الحالة راجعة إلى أحد العوامل الغير حيه في التربة، كنقص العناصر أو في الجو كتأثير ملوثات الهواء.   

3- ظهور الحالة كبقع متناثرة في الحقل يرجع أن الحالة راجعه إلى أحد الممرضات المحمولة بالتربة مثل أمراض عفن الجذور والذبول الوعائي. وعلي المشخص أن يلاحظ ما إذا كان هناك علاقة بين توزيع الحالة وطبوغرافية الحقل.

4- ظهور الحالة على حافة الحقل يرجح أنها راجعة إلى ممرض محمول بالحشرات.

ب- ملاحظة توزيع الأعراض على النبات:

تختلف توزيع الأعراض على النبات باختلاف العامل الممرض وأحيانا تبعا للظروف البيئية فى حالة الممرض الواحد. فهناك ممرضات تتميز بأنها تحدث الإصابة فى الأوراق الحديثة وهناك ممرضات تحدث الإصابة فى الأوراق الكبيرة ، وربما يكون تفضيل بعض الممرضات للأوراق السفلى راجع إلى أنها تحتاج إلى رطوبة مرتفعة تكون أكثر توفرا فى الجزء السفلى من النبات قرب سطح التربة.

ج- فحص الأعراض والعلامات بدقة علي النباتات المصابة:

  على المشخص أن يكون على دراية تامة بالحالة الطبيعية للنبات والمظهر العام للنمو فى مثل هذا العمر وتحت مثل تلك الظروف حتى يمكنه أنه يضع يده على الخلل الحادث فى النمو.  وعليه أن يقوم  بفحص الأعراض بدقة علي نباتات مختلفة  يبدو عليها درجات متفاوتة من التأثير وعلية فحص العلامات المرضية بدقة ، وعليه أن يستعين بعدسة إذا لزم الأمر عند فحص الأعراض والعلامات . كما يجب عليه أن يصنف تلك الأعراض تبعا لنوع العمليات الحيوية التى حدث بها خلل فى النبات ، فكل نوع من أنواع الخلل يشير إلى الارتباط بنوعية معينة من الممرضات على النحو التالي:

1- حدوث عجز فى نمو الأعضاء و الأنسجة

مثل حالات التقزم العام أو قصر طول سلاميات النبات أو عجز نمو الجذور أو نقص عدم انتظام تكون الكلوروفيل أو الصبغات الأخرى ، أو فشل الإزهار أوعقد الثمار.

2- موت أنسجة أو أجزاء من النبات

ربما كانت تلك من أكثر نوعيات الأعراض ظهورا وهى تتضمن تبقع الأوراق والاحتراق الحواف وموت أوارق بالكامل والموت الطرفى للأفرع وأعفان الثمار.

3- التغير العام فى المظهر

وتتضمن حالات عدم انتظام  توزيع الكلوروفيل فى الأوراق والأزهار ، مثل أنماط الموزاييك وتفتح الأوان الأزهار.

4- حدوث زيادة فى النمو عن الحالة الطبيعية

مثل  الأورام وتجعد الأوراق وتكون عقد على السوق والجذور ومكنسة الساحرة والإزهار الغزير.

** وبوجه عام يجب على المشخص عند فحص الأعراض  مراعاة الأتي:

1- بينما تكون بعض الأعراض مميزة ومرتبطة تماما بأمراض معينة حتي أنها  تدخل في الاسم الشائع للمرض ، فهناك ممرضات تعطي أعراض شديدة التشابه بل أنها قد تتشابه مع أضرار بيئية.

2- قد تختلف أعراض المرض الواحد باختلاف الظروف البيئية.

3- قد يسبب ممرض ما أعراضا مختلفة علي نفس العائل باختلاف مراحل نموه.

4- قد يصاحب الأنسجة المصابة وجود كائن حي دقيق أو أكثر ولكن ذلك ليس بالعلامات المرضية ولا هي بمسبب المرض إذ أن الكثير من الرميات لها القدرة علي النمو علي النسيج المصاب سريعا. وقد تكون الحالة  متسببة عن أكثر من ممرض.

5- قد تظهر أعراض المرض على المجموع الخضرى إلا أن الإصابة بالممرض تكون فى الجذور ، على سبيل المثال كما فى حالات إصابة جذر النبات بفطريات أعفان الجذور ونيماتودا الجذور والتى تظهر على المجموع الخضرى أعراض العطش ونقص العناصر وقد يصل الأمر إلى  حدوث موت فى أنسجة الورقة بما يشبه تبقعات الأوراق.

6- في بعض الحالات تكون الإصابة مركبة بمعنى أن أنها ناتجة عن ممرضين أو أكثر ، مثل   المرض المركب عفن الجذور والذبول wilt complex- Root rot. من ناحية أخرى قد تظهر على النبات أعراض لمرض طفيلي  مع أخرى ناتجة عن اضطرابات فسيولوجية ، ومن أمثلة ذلك أن إصابة النبات بأمراض الذبول الوعائي وأعفان الجذور والأمراض النيماتودية التي تصيب الجذور غالبا ما يصاحبها أعراض نقص مركب للعناصر لعدم حصول النبات على احتياجاته على نحو كاف عند الإصابة بمثل هذه الأمراض.

7- قد يظهر على النبات إلى جانب المرض المسبب للمشكلة أحد الأمراض غير المؤثرة بدرجة كبيرة على ذلك المحصول فى مثل تلك الظروف ، ويجب على الشخص أن يراعى ذلك بدقة ولا يجتذب انتباهه المرض القليل الأهمية عن المرض المسؤول فعلا عن المشكلة.

8- على المشخص المبتدئ أن يستعين بكتب أو كتيبات أمراض النبات ذات الصور الملونة ليطابق عليها ما يراه ، نظرا للتشابه الكبير بين أعراض أكثر من مرض على النبات الواحد.

9- علي المشخص أن يكون علي دراية تامة بالأعراض المختلفة التي تحدثها الإصابة بالآفات الحشرية حتى لا يلتبس عليه الأمر.

** يجب على المشخص عند الذهاب إلى حقل المشكلة أن يراعى الأتى .

1. أن يكون ملاحظا جيدا لتوزيع الحالة فى الحقل والأعراض وكل ما يحيط بالمشكلة من ظروف مثل بطبوغرافية الأرض ونوع التربة ونظام الرى   ... الخ.

2. أن يكون مستقصى جيد لكل ما يريد معرفته من المزارع فربما يكون فى تلك المعلومات مفتاح حل المشكلة أو استبعاد لاستنتاج مبدئى خاطئ. وفى هذا الشأن يجب أن تكون الأسئلة قصيرة وواضحة ويفضل أن تكون الإجابة عليها بنعم أولا.

3. إذا كانت الحالة ميئوس منها وهناك مجرد احتمال لجدوى إجراء معين فيجب عليك مصارحة المزارع بذلك حتى لا تكون مفاجأة له فى حالة عدم الحصول على نتيجة.

4. ألا يخدع المزارع  فإذا لم يكن واثقا تماما من تشخيصه فعليه إبلاغ المزارع  بعدم توصله لتشخيص محدد وأن الأمر يتطلب إجراء بعض الفحوص المعملية لإتمام عملية التشخيص  فكلمة ” لا اعرف ” أفضل من الخداع لأن الخداع يفقده ثقة المزارع ، كما أن العميل قد يكون عرض المشكلة على مشخص آخر قبله أو سيعرضها على آخر بعده.

5. على المشخص أن يتذكر أنه ضيف فإذا تطلب الأمر حفر حول أشجار لأخذ عينة من الجذور على سبيل المثال ، فعليه أن يستأذن فى ذلك من صاحب المزرعة.

6. إذا كان بالمزرعة نباتات أو أشجار مثمرة فلا تمتد يده لتناول ثمار إلا إذا دعى إلى ذلك.

7. أن يعتبر كل مشكلة يقوم بتشخيصها كأنها تحدى شخصى له.

    إذا لم ينجح المشخص فى تشخيص الحالة فى الحقل وإعطاء التوصية المناسبة فعلية أن يأخذ عينة إلى المعمل لإجراء فحوص معملية دقيقة ومناقشة الحالة مع زملاءه إذا تطلب الأمر.

- وقد يقوم صاحب المشكلة نفسه بأخذ عينة والتوجه إلى معمل التشخيص. فما هى مميزات العينة  الجيدة ؟

*********************

ثانيا : الحصول علي بعض المعلومات

قد لا يصل المشخص بناء علي ما سبق إلى قرار محدد وقد يكون أمام اكثر من خيار ويحتاج لبعض المعلومات لترجيح أي من هذه الخيارات وعلى ذلك فانه يقوم بالحصول علي هذه المعلومات من المزارع وتدوينها في بطاقة بيانات تشخيص المرض ونأخذ من ذلك مثالا واحد وهو أن الإصابة ببعض الفيروسات قد تتشابه مع الأضرار التي يسببها الرش ببعض منظمات النمو أو مبيدات الحشائش وبسؤال المزارع عن المعلومات التي أجريت وتاريخ إجرائها يمكن الوصول إلى قرار صائب.

إذا توصل المشخص إلى قرار معين فإنه يعطي التوصية المناسبة للمزارع والتي تتراوح بين عدم اتخاذ أي إجراء إذا كان المرض عارض واحتمال تقدمه ضعيف إلى أجراء معاملة علاجية معينة وقد يصل إلى التوصية باقتلاع محصول حولي وإحلال أخر إذا كانت الإصابة في مرحلة متقدمة ومتزايدة ولا وسيلة للعلاج . أما إذا لم يتوصل إلى نتيجة فأنة يأخذ عينات مناسبة من النباتات المصابة ويرجع بها إلى المعمل لإجراء الفحوصات المعملية.

** مميزات العينة الجيدة:

1- يجب أن تتضمن عينة النباتات المصابة  نباتات كاملة فى حالة النباتات الحولية والشتلات وأن تتضمن فروعا وأجزاء من الجذور فى حالة الأشجار.  

2- يجب حفر التربة للحصول على الجذور سليمة لأن جذب النبات يؤدى إلى تمزيق الجذور.

3- يجب أن تتضمن العينة ما لا يقل عن 6 نباتات تعبر عن درجات مختلفة من الأعراض.

4- يوضع كل نبات مصاب فى كيس ورقى وتوضع نباتات العينة مجتمعة فى كيس من البولى إثيلين.

5- تجمع عينات النباتات المصابة فى الصباح ويجب أن تصل  إلى مقر العيادة  فيما لا يزيد عن أربعة ساعات حتى لا تتدهور فتصبح غير صالحة لأعمال الفحص وفى حالة نقل العينة من مسافة بعيدة أو فى الجو الحار تنقل العينة داخل صندوق مبرد.

 6- يجب تجنب تلويث المجموع الخضري للنبات بحبيبات التربة ، أما الجذور فتغسل بحرص لإزالة حبيبات التربة من على سطحها مع تجنب كشط سطح الجذر أثناء الغسيل فتزيل جزءا هاما لعملية التشخيص.

***********************

ثالثا: تشخيص المرض في المعمل:

عند الوصول إلى المعمل تجرى عدة اختبارات مختلفة لمحاولة تشخيص المرض ومعرفة المسبب المرضى له , وفى كل الأحوال يجب اتباع الآتي:

1. يتم عمل فحص ميكروسكوبي مبدئي سريع لإعطاء فكرة أفضل وسريعة عن المرض.

2. في حالة عدم وضوح الأعراض توضع العينة في غرفة رطوبة وذلك لتشجيع نمو المسبب المرضى.

3. أن يتم العزل من المنطقة الفاصلة بين الجزء المصاب والجزء السليم , وعدم العزل من الجزء المتعفن والمتهالك لأنة تكثر به المترممات.

4. إذا كان المسبب المرضى موجود على سطح العينة يفضل عدم عمل تعقيم سطحي , على العكس من ذلك إن كان المسبب المرضى بداخل العينة.

5. يفضل استخدام بيئات متخصصة عند العزل وذلك للحد من المترممات.

وعموما توجد طرق متعددة ومختلفة لتعريف الميكروبات المتحصل عليها , حيث تختلف هذه الطرق تبعا لاختلاف الميكروب المعزول وأيضا طبقا للإمكانات المتاحة , ويمكن تقسيم هذه الطرق إلي مجموعات على النحو التالي:

أولا: الاختبارات الفسيولوجية:

وهى الطرق التي تعتمد على العمليات الحيوية المختلفة التي يقوم بها الميكروب أو بمعنى آخر قدرة الميكروب على تحليل مركبات معينة . ومن أهم هذه الاختبارات : البصمة التنفسية , تخمر السكريات , تحليل الدهون , تحليل النشا , تحليل الجيلاتين , اختزال النترات , إفراز التوكسينات , KOH وتكوين اللويفان.

1- اختبار البيولوج  Biolog:

هو اختبار يستخدم في تعريف الكائنات الدقيقة (البكتريا , الفطريات , الخمائر) وهو يتكون من كمبيوتر وقاعدة بيانات لقراءة تضم أكثر من 1900 نوع من الكائنات الدقيقة ويمكن تحديثها سنويا , كما أنة يمكن قراءة النتائج بالعين المجردة أو باستخدام قارئ أطباق مرفق بالنظام . وأيضا يمكن عمل رسوم ثنائية الأبعاد لتحديد صلة القرابة وحساب نسبة التشابه بين العزلات.

يسمى هذا النظام بالبصمة التنفسية Finger Print حيث أنة يعتمد على مقدرة الميكروب المراد تشخيصه على استهلاك مصادر مختلفة من الكربون والنيتروجين والليبيدات في أطباق شبيهة بأطباق الاليزا. وعموما استخدم هذا النظام بنجاح في مصر لتعريف العديد من المسببات المرضية المختلفة , ولكنة غير ملائم لتشخيص الفيروسات.

2- طريقة المنظر الجانبي للأحماض الدهنية:

وهى من الاختبارات الهامة التي انتشرت في السنوات الأخيرة والتي تستخدم في التفرقة بين أنواع البكتريا سالبة الجرام , وهى تعتمد على الاختلافات الوصفية والكميات النسبية من الأحماض الدهنية المفردة والمنظر الجانبي لها مثل الفاتى أسد , ثايكلوبان والسنتديت سيدس.

*******************

ثانيا: الاختبارات البيولوجية:

وهى الاختبارات التي تعتمد على علاقة الميكروب بالنبات أو كائن حي آخر وعموما توجد اختبارات عديدة تحت هذا القسم نذكر منها أهمها هي:

1- اختبار القدرة المرضية للمسبب المرضى  Pathogenicity test:

وهى تستخدم في تشخيص معظم مسببات أمراض النباتات عموما ماعدا الفيروسات ويتم ذلك عن طريق تطبيق اقتراحات كوخ على النحو التالي.

أ- مصاحبة المسبب المرضى للحالة المرضية , وظهور أعراض واضحة.

ب- عزل المسبب المرضى بصورة نقية بعيدا عن العائل.

ج- ظهور نفس الأعراض عند إعادة عدوى عائل سليم بالمسبب المرضى.

 د- إعادة عزل المسبب المرضى ومطابقته بالمعزول سابقا.

2- اختبار الحساسية الذائدة Hypersensivety reaction:

ويقصد به مدى تقبل النسيج النباتي للميكروب المحقون فيه وبالتالي رد فعل النبات الذي يعقب ذلك , والطريقة باختصار شديد هي حقن المسبب المرضى في نبات حساس جدا لهذا المرض وتسجيل الأعراض الناتجة , وهو من الاختبارات الهامة في البكتريا والفيروسات.

3- اختبار المدى العوائلى  Host rang test:

ويقصد به اختبار الميكروب على عدد معين من النباتات من نفس عائلة النبات الأصلي المعزول منة الميكروب ومقارنة الإصابة على هذه العوائل المختلفة. حيث أن بعض المكروبات لها مدى عوائلى واسع مثل البكتريا Erwinia carotovora والبعض الآخر ذو مدى عوائلى ضيق أو محدود مثل النوع Erwinia amylovora وبهذه الطريقة يمكن التفرقة بين هذه الأنواع المختلفة.

4- اختبار العوائل المفرقة Differential host:

وهى مجموعة من النباتات تصاب بنسب مختلفة من مسبب مرضى واحد , أي يختلف رد فعلها لنفس المسبب المرضى مثل نباتات الدخان والداتورة والونكا .... وغيرها , هذا الاختبار من الاختبارات الهامة في التعرف على العديد من الفيروسات والبكتريا والميكروبلازما.

5- النقل بالحشرات والحلم Transited by Insect and dodder :

وهو من الوسائل المتبعة في التعرف على بعض الفيروسات والميكروبلازما , وذلك عن طريق معرفة طريقة النقل هل هو خارجي أو داخلي , هل الميكروب يتكاثر داخل الناقل.

6- النقل بالبذور Seeds transition:

يمكن الكشف عن العديد من مسببات أمراض النبات في البذور وهى من الوسائل الشائعة في العديد من مسببات أمراض النبات من فطريات وفيروسات ...... وغيرها.

********************

ثالثا: التقنيات الميكروسكوبية:    Microscopy Techniques

استخدام التقنيات الميكروسكوبية لة قيمة عظيمة جدا في تشخيص أمراض النبات عن طريق التعرف على مسببات أمراض النباتات المختلفة وعمليات تطورها وتفاعلها مع عوائلها.

1- الميكروسكوب الضوئي: Light microscopy

ويستخدم في فحص الأعراض  وبعض العلامات على النباتات , كما أنة يستخدم في التعرف على العديد من مسببات الأمراض الفطرية وأيضا البكتيرية والنيماتودا , كما أنة يمكن الكشف عن الاسبيروبلازما داخل اللحاء بعد الصبغ . ويمكن رؤية بعض الأجسام التي تدل على وجود المسببات مثل رؤية الأجسام البلورية لفيروس موزايك الدخان (TMV) في نباتات الدخان. كما يستخدم في وصف كثير من الصفات المزرعيه والمورفولوجية للعديد من المكروبات النامية في أطباق بتري مثل لون المزرعة , حجم وشكل الجراثيم ...... وغيرها.

2- الميكروسكوب الإلكتروني:  Electron microscopy

استخدام الميكروسكوب الإلكتروني يكون هاما جدا في دراسة التفاعل بين النباتات ومسبباتها المرضية , وخاصة بعد إدخال مناهج الميكروسكوب الإلكتروني في دراسة دور كيمياء الخلية في المناعة وذلك بالتحكم العالي في وصف دقيق للعلامات المميزة وتصورها وخاصة التركيب البنائى الكامل أو وحداته الجزيئية. وإدخال تعزيزات الفيديو لاستخدامات الميكروسكوب قد أتاح تسجيل وقت حقيقي ملموس لما يحدث في الخلية الحية. وحديثا أدى استخدام الأجسام المناعية المعلمة بأشعة فلورسنتية والفحص الميكروسكوبي إلى تحسين فهمنا للتفاعل بين مسببات أمراض النباتات المختلفة وعوائلها. مع إدخال مركبات مميزة في طرق الكشف الفلورسنتية الجديدة والتقدمات الهامة في طرق التصوير الفلورسنتية , مما يتيح الآن دراسة الممرضات في النباتات وتفاعلها مع عوائلها باستخدام الطرق المختلفة.

وعموما يستخدم الميكروسكوب الإلكتروني في تشخيص معظم الأمراض النباتية ومسبباتها المختلفة من فطريات وبكتريا وفيروسات وشبيهاتها ونيماتودا ........ وغيرها.

**********

رابعا: الاختبارات السيرولوجية Serological assay :

وهى الطرق التي تعتمد على تحليل البروتين وهى تصلح مع معظم الكائنات الدقيقة ماعدا الفيرويد وتقسم إلي قسمين رئيسين هما:

أ- اختبارات الترسيب:

عيوبها :  1. تحتاج إلي كميات كبيرة من المواد (الانتيجين , الانتيبدى).

             2. متوسطة الحساسية.

             3. قد تؤدى إلى نتائج مضللة.

             4. وجود صعوبة في التقديرات الدقيقة للنتائج.

وتنقسم إلي :1- اختبار التجمع Agglutination test

2- اختبار الانتشار في الآجار

ب- اختبارات لونية:

مميزاتها :1. أكثر حساسية من اختبارات الترسيب.

            2. استخدام كميات قليلة جدا من الانتيجين والانتيبدى مقارنة بالاختبارات الأخرى.

          3. تعطى فكرة واضحة عن تركيز الفيروس في العينات.

     4. إمكانية الكشف عن عدد كبير من العينات في نفس الوقت.

1- اختبار أل ELISA  (Enzyme Linked Immuno Sorbet Assay) :

ويتم الاختبار في طبق الاليزا المعروف - ويوجد منها طرق مباشرة , طرق غير مباشرة وهى تستخدم بشكل أساسي في تشخيص الأمراض الفيروسية والتعرف على مسبباتها.

* أمثلة عن الأمراض التي تم تشخيصها بهذه الطريقة:

1- فيروس تحزم قمة الموز  Banana Bunchy Top Virus (BBTV)

2-  فيروس الاصفرار المتقذم في الشعير Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV)

2- اختبار أل ELISA-NCM  (ELISA-Nitro Cellulose Membrane)

يستخدم في هذا الاختبار غشاء النتروسيللوز الذي يتمتع بقدرته على ادمصاص البروتين, ويوجد نوعين لهذا الاختبار هما:

1. Dot blot  (DBIA) وفية يتم عمل تنقيط Spotting للعصارة على الغشاء.

2. Tissue-Print  (TPIA) وفية يتم عمل بصمة Printing للعصارة على الغشاء.

ج- اختبار أل Western blot:

يتم في هذا الاختبار تقدير البروتينات الموجودة في العصارة في إطار سلسلة من الإجراءات والخطوات التي تدخل ضمن ما يسمى بال Protein Electrophoresis.

بعد توزيع البروتينات إلى حزم (Bands) في الجل , مع ملاحظة ظهور Bands تمثل بروتين المسبب المرضى , بعد ذلك يتم نقل أل Pattern الموجود على الجل في مجموعة من البفر (Buffers) إلي غشاء النتروسيللوز , ثم بعد ذلك تستكمل خطوات الاختبارات السيرولوجية كما في اختبار ELISA-NCM.

يعتبر من الاختبارات الأساسية في الكشف عن الفيتوبلازما والاسبيروبلازما , ولكن لا تنجح مع الفيروسات وذلك لان الفيروس يحتوى على نوع واحد فقط من البروتين وهو الخاص بالغلاف.

* أمثلة عن الأمراض التي تم تشخيصها بهذه الطريقة:

- تشخيص الفيتوبلازما Deltocephalus vulgaris على قصب السكر.

********************

خامسا: التقنيات التي تعتمد على الحمض النووي Nucleic Acid Techniques:

تعتبر هذه الطرق من أهم وأدق الطرق التي تستخدم في فحص مسببات أمراض النباتات المختلفة, وهى تستخدم بنجاح في فحص وتشخيص وتعريف غالبية الكائنات الدقيقة ولكنها لا تنجح مع الفيتوبلازما وذلك بسبب صعوبة الحصول على الحامض النووي لها بصورة نقية.

مميزاتها:  1. الدقة العالية  

2. عدم استهلاك كميات كبيرة من المواد المستخدمة , فيكفى وجود جزيء واحد من الحمض النووي المراد الكشف عنة لبدء الاختبار والحصول على نتائج إيجابية.

            3. السرعة في الحصول على النتائج مقارنة بطرق التشخيص الأخرى.

            4. الكشف عن عدد كبير من العينات في وقت قياسي.

وسوف نلقى الضوء على بعض هذه الاختبارات كالتالي:

1- اختبار أل PCR   (Polymerase Chain Reaction)

يعتبر جهاز PCR واستخداماته من أهم الطرق المستخدمة حديثا في مجال تشخيص الأمراض النباتية والتعرف على مسبباتها. لأنة يتميز بالتخصصية العالية - الحساسية - السرعة. وتعتبر طريقة استخدام PCR من الطرق المعملية لإكثار الحامض النووي DNA والذي يمكن عن طريقة إكثار منطقة معينة مختارة من أل DNA والذي يصل إلى حوالي مليون ضعف وأصبحت ألان من أهم الطرق التي اعتمد عليها في إكثار جين محدد ذو تركيب محدد في معقد جيني. وتعتمد هذه الطريقة على تكرار الدورات في دراجات حرارة عالية وحرارة منخفضة.

* أمثلة عن الأمراض التي تم تشخيصها بهذه الطريقة:

1- الذبول البكتيري والعفن البني في البطاطس المتسبب عنRalestonia solanacarium.

2- اللفحة النارية في الكمثرى المتسبب عن البكتريا     Erwinia amylovora .

3- التقرح البكتيري في الموالح المتسبب عن Xanthomonas axonopodis pv. citri

4- التشخيص المبكر للتفحم المغطى في القمح المتسبب عن الفطر Tilletia tritici

5- التفرقة بين عزلات الفطر Verticillium dahliae المسبب لمرض الزبول الفرتسليومى على الزيتون.

6-  فيروس الاصفرار المتقذم في الشعير Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV)

7- من أفضل الطرق في تشخيص الأمراض المتسببة عن إجباريات التطفل التي لا تنمو على بيئات صناعية.

2- اختبار تهجين الحمض النووي DNA- Hybridization:

يتم فيه نفس خطوات أل PCR العادي ولكن يلزم وجود Probe معلم بمواد مشعة أو مواد إنزيمية مثل أل Dig أو biotin ثم يتم الكشف عن الإشعاع في النهاية من خلال استقبال الأشعة على أفلام حساسة مثل  X-ray Film أو يتم الكشف السرولوجى الخاص بال Antibodies لل Dig.

* أمثلة عن الأمراض التي تم تشخيصها بهذه الطريقة:

1-  فيروس الاصفرار المتقذم في الشعير Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV)

2- تشخيص الفيتوبلازما Deltocephalus vulgaris على قصب السكر.

3- اختبار RFLP   (Restricted Fragments Length Polymorphosum):

من أهم الاختبارات التي تستخدم للتفرقة بين سلالات البكتريا والفيتوبلازما , حيث يؤخذ ناتج أل PCR ويعامل بإنزيمات القطع Restriction enzymes ثم يفرد على الجل , الاختلافات في عدد أل Bands ومواقعها وحجمها في الجل يشير إلي الاختلافات في العينات المختبرة.

4- اختبار Southern and Northern Blots:

اختبار أل Southern Blot إذا كانت العينة DNA , واختبار أل Northern Blots إذا كانت العينة RNA , يتم في هذا الاختبار معاملة الحمض النووي (DNA & RNA & cDNA أو منتج أل (PCR بإنزيمات القطع , ثم يتم الفصل على الجل (Agarose gel) حسب الحجم . يتم النقل إلي غشاء النتروسيللوز باستخدام جهاز خاص وتحت تأثير قوى ضاغطة , تنقل قطع الحمض النووي من الجل إلى غشاء النتروسيللوز . بعد ذلك يتم تطبيق خطوات التهجين للحمض النووي كما في اختبار NASH ويستخدم أل Probe إما معلم بمواد مشعة أو بمواد ذات تفاعل إنزيمي.

*********************