إختيار الجزء النباتي ومعاملاته فى زراعة الأنسجة

إعداد أ.م/ سيد على محمد حسن أستاذ مساعد بقسم الفاكهه

مقدمه:-

                     يعتبر إعداد وتجهيز الجزء النباتي من أهم العمليات الواجب دراستها عند العمل بتكنيك زراعة الأنسجة حيث أن حالة النسيج الغذائية وكذلك الهرمونية ووجود بعض الأعراض المرضية أو الفطرية المصاحبة له من العوامل المحددة لنجاح النسيج النباتي فيما يلي هذا حيث يمر النسيج النباتي بعدة مراحل كما يلي:-

       يمر النسيج النباتي بعدة مراحل من بداية فصله من النبات الأم وزراعته على بيئة مغذية وحتى الحصول على نباتات كاملة لها القدرة على النمو في الحقل تحت الظروف الطبيعية .

       وتقسم الفترة التي يقضيها النسيج المنزرع على البيئة المغذية إلى مراحل مختلفة .وقد أوضح موراشيج أن هناك ثلاث مراحل يمر بها النسيج المنزرع وهى :-

-         مرحلة إنشاء المزرعة النسيجية .

-         مرحلة التضاعف على البيئة المغذية .

-         مرحلة تكوين الجذور .

بالرغم من أن هذه المراحل الثلاث تغطى المراحل التطورية التي يمر بها النسيج النباتي المنزرع في البيئة المغذية ، غير انه تم حديثا إضافة مرحلتين هامتين أحدهما تعنى بأعداد النبات الأم الذي يؤخذ منه النسيج لزراعته على البيئة المغذية والمرحلة الأخرى تعنى بتهيئة النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة لتتواءم مع الظروف الطبيعية المحيطة أي الزراعة في الحقل وبهذا تصبح المراحل التطورية التي تميز التكاثر بواسطة زراعة الأنسجة النباتية وهى:-

1--مرحلة إعداد النباتات الأم .

       2-  مرحلة إنشاء المزرعة النسيجية .

       3--مرحلة التضاعف على البيئة المغذية .

       4--مرحلة تكوين الجذور .

       5- مرحلة الأقلمة .

متطلبات مراحل الإكثار :-Requirement of micro-propagation stages

       مما لاشك فيه أن كل مرحلة من هذه ا لمراحل لها متطلبات يجب أن تراعى للحصول على استجابة عالية للنسيج المنزرع ، ولهذا فأننا سوف نتناول في هذا البحث مرحلة إعداد وتجهيز الجزء النباتي .

مرحلة إعداد النباتات الأم:- Preparation of mother plants                 

       من الأمور إلهامه عند بداية العمل التأكد من النوع والصنف النباتي المراد إكثاره ، وعدم التأكد من النوع النباتي يؤدى إلى الفشل في عملية الإكثار ذاتها.

       أثبتت التجارب العديدة في مجال زراعة الأنسجة النباتية أن استجابة النسيج المنزرع تتوقف على مدى قوة النبات الأم والموسم الذي يؤخذ فيه النسيج للإكثار بواسطة زراعة الأنسجة ، ولهذا فأنه يجب أن يراعى أن يكون النبات الأم خاليا من الإصابة بالأمراض وخاصة الأمراض الفيروسية.

       حيث أن قوة النبات تتأثر بعوامل بيئية متعددة ومتنوعة وهذه تشمل الحرارة ، والرطوبة ، والفترة الضوئية ، والكثافة الضوئية ،وتوفر المياه ، وتوفر الأسمدة .

       لهذا يفضل أن يحافظ على النباتات في الصوبة حيث يمكن التحكم في عوامل النمو المحيطة والحصول على أفضل نمو للنبات الأم .

       ولفهم السبب وراء الاستجابة المرتفعة للنسيج المنفصل من نبات ضعيف فأن هذا يرجع إلى التفاوت في مستويات كل من الكربوهيدرات والبروتين ومنظمات النمو .

       ولقد لوحظ الاستجابة المرتفعة للأنسجة النباتية المنفصلة من النبات الأم في المرحلة النشطة من حياته لهذا عندما يراد إكثار بعض الأنواع التي تتعرض لفترة من السكون ، فأنه يجب مراعاة أن تؤخذ النسيج النباتي أثناء فترة النشاط وليست فترة السكون ، وإذا احتاج الأمر فأنه يجب استعمال بعض منشطات النمو لإنهاء فترة السكون قبل فصل النسيج النباتي المراد زراعته.

إنتاج الأمهات :- 

       أساس عملية الإكثار هي اختيار الأمهات وعمل إكثار دقيق لها عن طريق التكاثر الخضري . وإذا لابد من حسن اختيارها جيدا لأن كل النباتات الناتجة منها تتوقف عليها . إذا لابد من الحصول على نباتات بشهادة (أمهات متميزة ).

·        الإكثار الخضري يعطى نباتات مشابهة للأم فأذا كانت الأم بها مشاكل فأن الأجيال تتوارثها.

·        أساس التطور في الإنتاجية أي في نوعية الثمار هي بداية اختيار أمهات جيدة وتحمل مثل هذه الصفات .

صفات الأمهات :-

1-    أن تكون ذات إنتاجية عالية جدا وذات مواصفات ثمار عالية الجودة .

2-    أن تمون خالية من الأمراض وخاصة الأمراض الفيروسية .

3-    أن تكون مطابقة لمواصفات الصنف الذي سوف يزرع .لأن أي خلل في مواصفات الشجرة الأم يعطى اختلافات جزئية عن الصنف المطلوب .

4-    لابد أن يمون النباتات الأم مطابق لمواصفات الصنف .

·        لكل نوع من أنواع النباتات المواصفات القياسية الخاصة به فبعض الأنواع مثل العنب المواصفات القياسية له تختلف عن الموالح .

مرحلة إنشاء المزارع النسيجية :- Establishment of tissue culture.                وهذه المرحلة تعتمد على الجزء النباتي وكذلك على البيئة المغذية ، ومدى التخلص من الكائنات الحية الدقيقة .

الجزء النباتي :-

       المقصود به الجزء الذي سوف يتم زراعته " حجمه ، نوعه ، العمر الفسيولوجى "

أولا :- حجم الجزء النباتي :-

       مهم جدا حيث يمكن أخذ جزء نباتي 2سم أو 0.1 مم وللجزء الكبير والصغير مميزات وعيوب لكل منها والهدف الذي يزرع من أجله :-

أ‌-       ففي حالة أخذ جزء نباتي وكان أكبر من المطلوب بالتالي فأن احتمالات نقل المرض موجودة (في حالة أصابه النبات بالمرض ) وفى هذه الحالة لابد من أخذ حجم النسيج صغيرا جدا ولابد أن تأخذه من القمه النامية وذلك لأن سرعة انقسام خلاياها سريعة جدا وبالتالي تكون خالية من الأمراض .

·        أما في حالة الجزء النباتي الكبير يؤخذ الجزء النباتي الكبير ويكون مفضل في حالة إذا كان النبات سليم وذلك للحصول على أفضل نمو وتطور للنسيج الناتج . وذلك لأن السمك الصغير يكون نموه بطئ والخلايا الصغيرة عرضة للموت أثناء التعقيم وفرصة التطور وانتاج النباتات تكون ضعيفة .

   ب-في حالة أخذ جزء نباتي كبير مصاب فأننا سنحصل على نبات مصاب نتيجة لانتقال جزء نباتي مصاب مع الجزء السليم ومن عيوب السمك الكبير أيضا زيادة التلوث وتلف النباتات الناتجة منه.

ج‌-       يفضل الجزء الصغير في حالة الإصابة الفيروسية .

  - يفضل الجزء الكبير في حالة النبات الأم سليم .

وعموما يجب أن لاتكون العزلة صغيرة جدا فقد ثبت أن القمة المرستيمية وحدها بدون بدايات ورقية متصلة بها يصيب زراعتها نظرا لما تقوم به الأنسجة الميرستيمية المتكشفة نوعا من إمداد القمة الميرستيمية بمصادر الهرمونات . وفى الموالح ثبت أن نسبة النجاح تزداد من 15-65 إلى 75 إلى 90 % عند زراعة القمة الميرستيمية مع صفر 2 ، 4 ، 6 بدايات ورقية على التوالي .

  وفى النجيليات كلما زاد طول القمه كلما زادت فرصتها للنجاح .

  وعلى ذلك يمكن القول أن القمة الخضرية أو البراعم الأبطية أكثر ملاءمة من القمم الميرستيمية ولكن في حالة إنتاج نباتات خالية من الفيروسات تصبح الصورة عكسية أي أنه كلما صغر حجم العزلة النباتية حتى الحد الأدنى اللازم للبقاء وانتاج نباتات جديدة كلما كانت فرصة النقاوة من الفيروس أضمن وأكبر .

  وبصفة عامة فلاستئصال الفيروس يمكن استعمال قمم ميرستيمية بطول من 0.2 إلى 0.5 مم ولو أن هناك حالات شاذة عن ذلك فبعضها لا يعطى جذور إذا كان أقل من 0.3 مم وبعض الحالات يمكن أن يخلو من الفيروسات حتى 5مم (حشيشة الدينار ) .

## ومن الأبحاث التي أجريت على حجم الجزء النباتي :-

         وجد Kassanis and Varma (1967) أن اختلاف أصناف البطاطس لاختلاف شكل وحجم المرستيم .

         ووجد نفس العلماء أن الميرستيم بطول 0.1 مم تحتوى على بدايات أوراق أولا وجد أن 20/196 من البراعم قد تطورت إلى نباتات ولكن 19 منها خالية من الفيروس.

         وفى دراسة أجراها Reinert and Bajaj(1976)  ذكر أن قمة الدوم عادة تكون أوسع عن الطول . عكس الحجم الكبير في النسيج وكثيرا من بدايات الأوراق .

         وفى دراسة أجراها  Hassan (1998) وجد أن زراعة القمة النامية أعطت نتائج أفضل في نمو وتطور الجزء النباتي وكذا الكلوروفيل بالمقارنة بالعقلة ذات البرعم الواحد في التوت ، بينما أعطت البراعم القمية بالأحجام المميزة أفضل النتائج بالنسبة للمانوليا .

ثانيا:- نوع النسيج النباتي :-

         يعنى هل النسيج من القمه النامية أو من فرع حديث أو من جذر أو ساق أو ورقة.

         ويفضل النسيج من جزء نباتي نشط وكما كان الجزء النباتي المستخدم من القمة النامية كان أفضل من أي جزء نباتي آخر لأن القمة النامية خلاياها مريستيميه نشطة سريعة التطور ويمكن الحصول على نبات متطور أسرع من أي جزء نباتي آخر وهى خلايا غير متخصصة.

         إذا أخذنا من أي جزء آخر غير القمة النامية لابد أولا من فقد الخلايا لتخصصها وتتحول إلى خلايا غادية متخصصة عن طريق وضع النسيج النباتي المتخصص على بيئة معينة فأن سطح النسيج الملامس للبيئة يتحول إلى خلايا برانشيمية نشطة (الكالوس) وهى خلايا سريعة النمو وغير متخصصة ثم تخصيص هذه الخلايا لتعطى ساق فقط أو جذر فقط .

فمثلا :- في النباتات الطبية والعطرية الجزء المهم الجذور لإنتاج المواد الفعالة .

موقع البرعم: Bud location

         كلما قرب البرعم من قمة النبات زادت فرصة نجاح زراعته وبالطبع فأن البرعم القمى أو الطرفي أكثر نجاحا من البرعم الجانبي ولكن نظرا لوجود برعم طرفي واحد لكل نبات فلابد من استعمال البراعم الأبطية أيضا .                                            

**الطرق المختلفة لزراعة الأنسجة :-

أولا : طرق التخليق المباشر :-Direct regeneration                        

         عبارة عن الحصول على المستهدف مباشرة دون المرور بمرحلة تكوين الكالوس.

الأجزاء المستخدمة باستخدام التخليق المباشر :-

1-زراعة القمة النامية " الزراعة المرستيمية"Shoot tip culture                     

2- زراعة العقلة ذات البرعم الواحد.

3- زراعة حبوب اللقاح والبويضات.

أولا:-ا زراعة القمة النامية ( الزراعة المرستيمية):-

         في حالة أخذ المرستيم القمى تسمى الزراعة المرستيمية وإذا أخذت كلها تسمى زراعة القمة النامية.

-         القمة النامية نبات كامل فيها مبادئ الأوراق ومبادئ أبط الأوراق التي تتطور وتعطى نبات كامل .

-         وهذه الطريقة من أفضل التركيبات المستخدمة في زراعة الأنسجة وذلك لقلة الاختلافات الجسمية التي تحدث في النباتات أو الأعضاء الناتجة من shoot tip   .

-         استخدام المرستيم يتوقف على الغرض من الاستخدام

أ‌-       إذا كان الهدف من الاستخدام إنتاج نباتات خالية من الأمراض .

ب‌-  إذا كان النبات مصاب بمرض فيروسي ويراد التخلص من هذا المرض ففي هذه الحالة لا نستطيع أخذ القمة النامية لأن الفيروس ينتقل إلى الجيل القادم ولكن يفضل أخذ المرستيم

     القمى بسمك 0.1 مم.

ج- إذا كان الهدف إنتاج كمية كبيرة من النباتات تأخذ القمة النامية .

          بعض الآراء تقول أنه إذا تم استخدام المرستيم يكون عدد النباتات اكبر من استخدام القمة النامية كلها : ذلك لآن كلما قلت حجم الجزء المستخدم كلما زادت حريتها فتعطى نباتات عديدة.

مميزات زراعة القمة النامية :-

1-    إنتاج نباتات متجانسة مشابهة للنبات الأم .

2-    أقل اختلافات وراثية تنتج من استخدام القمة النامية .

3-    إنتاج نباتات خالية من الأمراض الفيروسية باستخدام المرستيم القمى 0.1مم.

4-    إنتاج أكبر عدد من النباتات بمقارنتها ببقية الطرق المباشرة .

عيوبها :-

1-    تحتاج إلى دقة متناهية في فصل القمة النامية أو المرستيم القمة يؤدى إلى مشاكل كثيرة من تلوث وما إلى ذلك .

2-    تحتاج إلى فنيين مدربين بدرجة عالية في هذا المجال.

ثانيا:- زراعة العقلة ذات البرعم الواحد:-

          وهى لا تختلف كثيرا عن العقل في المشاتل .

مميزاتها:-

1-    أسهل الطرق في زراعة الأنسجة.

2-    قلة الاختلافات الوراثية في النباتات الناتجة منها لأنها تعتبر طريقة مباشرة .

عيوبها:-

في معظم الأحيان العدد الناتج من استخدام العقل ذات البرعم الواحد تعطى نبات واحد .

ثالثا :- زراعة حبوب اللقاح والبويضات :-       

       هذه الطريقة من أهم الطرق التي تستخدم في التربية لأن هذه الطريقة عبارة عن أنه عند زراعة حبوب اللقاح فأنها تحتوى على 1 n فهند زراعة حبة اللقاح تعطى نبات أحادى وعند زراعة البويضات تعطى نبات ثنائي .

       النبات الأحادي لحبة اللقاح مشابهة للنبات المستخدم كأب والنبات الأحادي للبويضة مشابهة للنبات الأم ولكن الشبه غير حقيقي لأن النبات الأب والأم زوجي نموه طبيعي والصفات المعبر عنها صفات طبيعية ولكن الأول نبات أحادى وكل صفة تحكم بجين واحد وهو نبات ضعيف ومعظم الصفات به ضعيفة وتوجد بعض المشاكل في نبات الأب حيث الجينات زوجية أي الكر وموسوم زوجي . ونفترض ترتيب الجينات عليه كالآتي :-

حبة اللقاح  A  B  C  D   

البويضة  A  B  C  D    

وبالتالي الترتيب في حبة اللقاح A  B  C  D      أما البويضة فتكون A  B  C  D      وبالتالي النبات يكون عقيم ولكي هذا النبات خصب يجب عمل تضاعف له وذلك بالكلوشسين وبالتالي يحدث الآتي :-

A  B  C  D                                                        a  b  c  d 

A  B  C  D                                                   a  b  c  d

مميزات زراعة حبوب اللقاح والبويضات :-

1-    تنقية النباتات وراثيا.

2-    حبة اللقاح والبويضة توجد في النبات بوفرة ولا تؤثر على النبات .

عيوبها :-

1-    معقدة جدا وتحتاج إلى متخصص وتدريب عالي .

2-     سريعة التلوث لأنها تحتاج إلى مراحل كثيرة حتى الوصول إلى نبات واحد .

زراعة الأجنة :- Embryo culture                                                             

عبارة عن زراعة الجنين الجنسي الذي يتعرض لبعض المشاكل الموجودة داخل البذرة الموجودة داخل البذرة الموجودة بها التي تؤثر عليه بطريقة قاتلة لو استمر في البذرة.

ويتم استخلاص الجنين قبل النضج وقبل وصوله إلى الإجهاض ويتم زراعتها وتنميتها .

فصل البروتوبلاست :-

                عبارة عن خلية منزوعة الجدار وذلك لعدة أسباب :

1-    نقل بعض العوامل الخارجية إلى داخل الخلية – مثل نقل DNA  لنبات مقاوم للحرارة أو البرودة إلى نبات آخر ويتم إضافته بالوسط المحيط بالبروتوبلاست للنبات الذي سوف ينقل له وبالتالي فمن السهل اندماج DNA.

2-    في حالة استخدام طفرات .

3-    بدلا من النمو محددا بغلاف خارجي فيكون أسرع .

المشكلة :-

       أي ضغط خارجي إذا كان بالزيادة أو النقصان يؤثر على الخلية فان كان الضغط الاسموزى الخارجي أعلى من الضغط الداخلي فالخلية يحدث لها انفجار أو أي شئ لذلك فأن عند نزع البروتوبلاست يجب ثبات الضغط الأسموزى بحيث يحافظ على الشكل الطبيعي للخلية.

طرق إزالة الغلاف الخارجي :-

1-    الطرق الميكانيكية :- يتم وضع الخلية في جهاز الطرد المركزي ويتم زيادة سرعته فيكسر جدار الخلايا ولكن توجد خطورة عالية لأنه يؤدى إلى موت عدد كثير من الخلايا .

2-    الطرق الكيماوية :-يتم تعريض الخلايا للأنزيمات التي تهدم الجدار الخارجي حيث يتم عمل خلطه من أنزيم السيليلوز والهيميسيليلوز والبكتين وبالتالي تعمل هدم لجدار الخلية وبالتالي يبدأ ظهور البروتوبلاست.

دمج البروتوبلاست :-

-         التهجين الجسمي:- عبارة عن خليتين جسميتين يندمجان مع بعض لأنتاج نبات يجمع صفتيهما .

-         التهجين الجنسي :- وهو اتحاد الجاميطة المذكرة من صنف الجاميطة المؤنثة لصنف آخر.

مميزات التهجين الجسمي (الأجنة الجسمية) :-

1-    تخليق تراكيب نباتية ذات ريشة وجذير في خطوة واحدة.

2-    أسهل وأقل في التكلفة .

3-    أقل في الوقت.

4-    أقل عرضة للتلوث.

5-    يمكن الحصول على عدد كبير من الأجنة في نفس الدورق أو الإناء .

6-    في حالة المعلقات الخلوية تكون الأجنة طافية فوق السطح مما يسهل عملية الفصل والنقل إلى أواني مناسبة حتى تعطى النبات الكامل .

7-    يمكن إدخال الأجنة الجسمية في طور سكون وأخراجها منه في الوقت اللازم مما أعطى فرصة لمعاملتها على أنها بذرة بحيث يتم أحاطتها بكبسولة وهى ما يسمى البذور الصناعية .

8-    وسيلة لحفظ المادة الوراثية بالتخزين البارد أو الجاف لمدة طويلة .

9-    تخليق الأجنة بغرض الحصول على المادة الفعالة المميزة لهذا النوع النباتي في الطبيعة والأجنة تكون حاملة لأكبر قدر ممكن من المادة الفعالة .

العزلة النباتية :-Explant                                                                         هناك بعض الأنواع مثل الجزر D. carota          وهو اكثر لدراسة ظاهرة تخليق الأجنة حيث يمكن استخدام أي جزء من النبات في أي مرحلة من مراحل النمو كمصدر أو كعزلة لبداية الزراعة أما في أنواع أخرى يفضل استعمال جزء نباتي معين للحصول على مزارع ذات قدرة عالية على إنتاج الأجنة High embryogenic capacity  ويظهر ذلك بوضوح في النجيليات حيث يفضل استعمال الأجنة الحديثة التكوين مع وضعها على البيئة بحيث تكون المحور الجنيني هو الملاصق للبيئة كما تستعمل أجزاء من النورة الحديثة في أنواع السور جم أما في جنس الموالح الحديثة التكوين .

  وبذلك يمكن القول أن الأنسجة الميرستيمية والجنينية والزهرية هي أكثر الأنسجة إنتاجا للأجنة عند زراعتها تحت ظروف المعمل .

الحالة الفسيولوجية للنبات الأم :-

            لابد من التأكد أن المصدر النباتي في حالة نشاط حيث يؤثر على مدى نشاط الأنسجة وقدرتها على تكوين الأجنة .

التضاعف الكروموسومى :-

            لا يؤثر على تخليق الأجنة حيث أن الأجنة تنشأ من خلايا أحادية أو ثنائية أو ثلاثية أما إذا كان التغيير الكروموسومى بالنقص فأنه يمنع تخليق الأجنة.

الطرز الجينية :- Genotype                                                                             وهى تؤثر على مقدرة الأنسجة على إعطاء أجنة .        

*** الدراسات التي أجريت على مصدر الجزء النباتي :-

    وجد Tisseral 1979 a,b 1981 a)) أن أفضل منشأ للكالوس وأفضل نمو يكون من المنفصل من الأماكن أو المناطق المرستيمية في النخيل والذي يشمل الزيجوت والأجنة والقمة النامية , وأوراق البراعم الجانبية .

    كما وجد أن المرستيم و ال  rachellae  و petiol   وكذلك الجزء النباتي للجذر , والأوراق ز أيضا سهل كان أقل حجم في نجاح مرحلة establishment  في كالس النخيل بـ embryogenic   . هذه الأبحاث لـ :-

Apavatjrut & Blake(1977) ; Eeuwens,1976,1978; Eeuwens & Blake1977; Reuveni & Lilien-Kipnis 1984; Reuveni et al.1972; Tisserat,1979.                                                                                                    كما وجد Rabechault et al.1970;Smith & Jones 1979    على الOil palm   ووجد De Guzman et al 1979 على الـcoconut   أن الجنين الزيجوتى كان مصدر للكالس embryogenic.

    Embryogenic كالس كان أفضل في cotyledonary  في إنبات جنين palm     (Ammar & Benbadir,1977)  .

    كما وجد Eeuwens 1978; Sherma et al.,1980 أن الـكالس كان افضل من الساق والأوراق .

    ووجد Apavatjrut & Blake 1977  أن افضل جزء هو الساق والنورة في جوز الهند.بينما هذا الكالس لا يعطى زيادة في الـesexual embryomenic  .

    غالبا الجزء النباتي ينقسم من أعضاء خاصة أعطى زيادة إلى الكالس والتي أنتجت جذور فقط Tisserat 1979  .

Rabechault & Martin 1976      وجدا أن إنتاج الكالس كان أفضل من الأوراق الصغيرة المرستيمية , البراعم الجانبية و  النشطة وتكون الأوراق , القمة النامية في date palm  وقد لوحظ لاستمرار التطور في in vitro  خلال إنشائية الورقة .

    ومن الثابت أن خصائص البراعم الغير ميرستيمية بغياب الأوراق نسبيا في الزراعة لقليل من الأيام Tisserat,1979   .

موسم العزل:ٍSeason