الكشف والتوصيف الجزيئى لبعض العدوي الفيروسية فى

أسماك وقشريات المياة البحرية

                                         رسالة مقدمة من

ط.ب/ رندا يسري السيد ثابت

                بكالوريوس العلوم الطبية البيطرية– جامعة الزقازيق 2012

                ماجستير العلوم الطبية البيطرية – جامعة قناة السويس 2015

تحت إشراف

أ.د/ صلاح الدين مصيلحى على 

 أستاذ ورئيس قسم الباثولوجيا – كلية الطب البيطرى  – العميد السابق لمعهد الأستزراع السمكى وتكنولوجيا الأسماك – جامعة قناة السويس

د/ شيماء محمد جلال منصور

أستاذ مساعد الفيرولوجيا – كلية الطب البيطرى – جامعة الزقازيق

مقدمة إلى

 معهد الاستزراع السمكى وتكنولوجيا الأسماك

جامعة قناة السويس

للحصول على درجة

الدكتوراه 

فى مكافحة أمراض الاستزراع المائي

قسم مكافحة أمراض الاستزراع المائى

معهد الاستزراع السمكى وتكنولوجيا الأسماك – جامعة قناة السويس

2019

الملخص العربى

تشهد صناعة الجمبري والأسماك فى مصر تقدما مطردا لتلبية متطلبات السوق خاصة فى المناطق الساحلية. حيث أن الاستزراع المائى فى الجمبري والأسماك يشكل مصدرا هاما وغنيا للبروتين والمغذيات الأخرى للاستهلاك الأدمى. وقد يؤثر خطر الإصابة بالفيروسات فى مزارع الجمبري والأسماك بشكل سلبى كبير على إنتاج الاستزراع المائى. حيث لا يوجد سوي دراسات قليلة جدا فى مصر على الأمراض الفيروسية فى أسماك وقشريات المياه البحرية،لذا كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تشخيص بعض الأمراض الفيروسية فى الجمبري و الأسماك المصرية مثل  IMNV و IHHNV و  WSSV فى الجمبرى والـ LCDV  فى أسماك الدنيس البحرى عن طريق الفحص الظاهرى والنسيجى ومن خلال الطرق الجزيئية مثل:

 RT-PCR و PCR لتشخيص الحامض النووى الفيروسي فى أنسجة عينات الجمبري المصابة بهذه الفيروسات،واختيار التتابعات الجينية وتحليل الشجر الجينية.

وتتقدم أيضا صناعة واستزراع الأسماك فى مصر بشكل ثابت وسريع وذلك لمواجهة متطلبات السوق المحلى، لكن خطورة العدوى الفيروسية فى المزارع السمكية قد تؤثر بشكل كبير على أنتاجها . حيث أنه لا يوجد دراسات على فيروسات الأسماك فى مصر، لذلك فإن الهدف الرئيسى لهذه الدراسة هو التحرى عن وجود وأنتشار هذه الفيروسات فى الأسماك المصرية وتطوير وسائل الكشف الجزيئية جديد لتشخيص الحامض النووى الفيروسى فى أنسجة عينات الأسماك المصابة بهذه الفيروسات.

ولتحقيق هدف هذه الدراسة، تم جمع 60 عينة جمبرى و40 سمكة أسماك بحرية من منطقتى تقعان على ساحل البحر الأبيض المتوسط. المنطقة الأولى هي مثلث الديبة محافظة دمياط. المنطقة الثانية بحيرة البردويل، محافظة شما سيناء. هذه العينات تتضمن 40 عينة جمبرى مصاب و20 عينات من سمكة الدنيس بها شك بأن تكون مصابة بالمرض.

تم الكشف عن جميع عينات الجمبرى وسمك الدنيس للفحص الظاهرى وأيضا لفحص الأنسجة المرضية وتم فحص العينات المشتبه بها من أججل فحص تأثير الفيروسات على الخلايا حيث تم حفظ جزء من أنسجة الجمبرى فى محلول  DAVIDSON لفحص الأنسجة المرضية للجمبري وتم جمع جزء أخر من عضلات الجمبرى لأجراء الكشف الجزيئى  لـ IMNV و IHHNV و WSSV وأيضا تم حفظ جزء من أنسجة سمكة الدنيس البحرية فى 10% من محلول الفرمالين لفحص أنسجة الأسماك المرضية والجزء الأخر من الزعانف والجلد من سمكة دنيس لأجراء الكشف الجزيئى لـ  LCDV .

يظهر النسيج العضلى فى الجمبرى المصاب بفيروس IMNV أبيض اللون، تكون معظمها فى منطقة البطن ومنطقة الذيل مما يعطى مظهرا للجمبرى كأنه مطبوخ. لذلك، تم أستخدام هذه العلانات التشريحية للتشخيص المبدأى IMN.

وأيضا أرتبط الجمبرى المصاب بفيروس IHHNV بمتلازمة تشوه الرانش أو تشوه الجزء الأمامى من قشرة الرأس الخارجية ( RDS)، مما تسبب فى أنخفاض كبير فى معدل النمو. يظهر الجمبرى المصاب بعضلات عضلية معتمة وذات نقط حبيبية بيضاء على بقعة من القشلرة الخارجية، خاصة عند المنطقة التى تربط الرأس مع البطن مع الأختلاف فى الحجم.

بينما أظهر الجمبرى المصاب بفيروس الندب البيضاء  WSSV بقشرة خارجية رخوة ويمكن فصلها بسهولة عن البشرة الداخلية مع وجود العديد من البقع البيضاء المرئية المتناثرة الظاهرة على السطح الخارجى والأكثر وضوحا على السطح الداخلى مع بعض التشوهات فى القشرة الخارجية والعضلات غير الشفافة.

تظهر أسماك الدنيس البحرية المصابة بفيروس LCDV ظاهرية مميزة بالعدوى وهى أورام ليفية متعددة البقع البيضاء او دائرية حيث توجد هذه الأورام على الجلد والزعانف والعينين والفم يمكن أكتشافها بسهولة بالعين المجردة. يعتمد تشخيص هذا المرض الفيروسى بشكل عام على مراقبة الجلد. وقد شوهدت أورام كثيرة فى جميع أنحاء الجلد خاصة فى الزعانف الصدرية والظهرية والذيلية.

تم أعداد أنسجة الجمبرى بصبغها بصبغة  H&E لفحص الأنسجة المرضية للتحقق من التغيرات النسيجية فى الجمبري المصاب. وأظهرت العضلات الهيكلية تلف فى البطن والمنطقة الصدرية البطنية. أظهر الفحص النسجى المرضى تغيرات مثل تلف الأنوية، وأرتشاح وتخثر الخلايا والألتهاب الليفى فى العضلة الهيكلية للجمبرى المصاب بفيروس  IMNV كما وجد أيضا الـ   INCLUSION BODIES  داخل السيتوبلازم لخلايا العضلات.

يوفر الفحص النسيجى لظاهرة النواة الداخلية نوع  Cowdry A تشخيصا مؤقتا للعدوى الفيروسية IHHNV  توجد جسيمات مميزة لفيروسIHHNV وهى جسيمات ذات صبغة بنفسجية وتظهر غالبا داخل نواة مبطنة بالكروماتين وتم تسمية التغيرات النسيجية فى أنسجة الجمبرى المصاب بأنحلال خلوى واسع الأنتشار وتضخم شديد فى النواة. أظهرت العضلات البطنية المتأثرة تليفا حادا يسمى بـ  Zenker.

أما عن نتائج الفحص الباثولوجى لأنسجة الجمبري المصاب بفيروس  WSSV توجد أجسام نواوية محبة للصبغات القاعدية فى أنوية الخلايا مغلفة بمادة الكروماتين فى الأنوية المتضخمة مع وجود تجاويف فى الأنسجة ككل مع وجود تكسير وزيادة أرتشاخ للخلايا الليمفاوية بها.

وأظهر الفحص النسيجى لسمك الدنيس المصاب بفيروس LCDV وجود جسيمات داخل السيتوبلازم، وتضخم النواة وتضخم خلوى بالإضافة إلى ذلك لوحظ وجود تحوصل هلامى سميك يحيط بالأورام الليفية المتضخمة.

لضمان أن عينات الجمبرى التى تم جمعها مصابة بفيروسات IMNVوIHHNV  وWSSVتم أستخراج الحمض النووىRNA والحمض النووى DNAمباشرة من العينات التشريحية المجمعة وتحليلها مع بادئات محددة بفيروس  IMNV بأستخدام   RT-PCRوكذلك بفيروسات  IHHNV  وWSSV بأستخدام طريقة PCR. أعطت نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل  PCR منتجا متوقعا عند جزء 139،81،414   bp بواسطة الجيل بلأستخدام جهاز الفصل الكهربائى على التوالى، تم الحصول على هذه النتيجة من عينات الجمبري الإيجابية التى تم تأكيدها من قبل من خلال التشرح المرضى. تمثل هذه العينات عزلات من موقعي جغرافيين فى مصر بما فى ذلك مثلث الديبة وبحيرة البردويل.

للتأكد من العينات التى تم جمعها من سمك الدنيس مصابة بفيروس  LCDV ثم أستخراج الحمض النووى مباشرة من العينات التشخيصية المجمعة وتحليلها مع بادئات محددة لفيروس   LCDV فى طريقة  PCR أعطت نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل(PCR) منتجا متوقعا عند جزء 405 bp بواسطة الجيل بأستخدام جهاز الفصل الكهربائى. تم الحصول على هذه النتيجة من عينات إيجابية لسمك الدنيس البحرى التى تم تأكيدها من قبل من علم التشرح المرضى. تمثل هذه العينات عزلات من موقعى جغرافيين فى مصر بما فى ذلك مثلث الديبة وبحيرة البردويل.

كانت نتائج الـ PCR الإيجابية فى عينات الجمبرى وأسماك الدنيس المصابة تقييم للخصائص الوراثية للفيروسات عن طريق تسلسل التتتابعات أو النوكليوتيدات وتحليل هذه التسلسلات مع تسلسلات نيوكليوتيدية أخرى ذات صلة على الجين بنك. ترتبط عينات IMNV بتسلسل عينات IMNV من الولايات المتحدة الأمريكية والبرازيل وأندونسيا بنسبة تشابه 80.3-83.6 %، وترتبط عينات IHHNV بتسلسل عينات IHHNV من مصر والصين وكوريا وفيتنام وتيوان والأكوادور بنسبة تشابه 97.7 -100% وترتبط عينات WSSV بتسلسل عينات من مصر وكوريا وتيوان بنسبة تشابه 95-100% ، أما فى أسماك الدنيس البحرى ترتبط عينات LCDVبتسلسل عينات من كوريا وكندا والولايات المتحدة الأمريكية وتونس واسرائيل بنسبة تشابه 80- 89.7%

من النتائج التى تم الحصول عليها يمكننا أن نستنتج ان IMNV و IHHNV و WSSV   فيروسات تصيب الجمبري المصرى وتنتشر بين أنواع الجمبرى المختلفة فى المحافظات الساحلية وأن  LCDV فيروس يصيب الأسماك البحرية المصرية خاصة أسماك الدنيس البحرى.

إعداد وإشراف / منى محمود

ساحة النقاش

مكتبة الهيئة العامة لتنمية الثروة السمكية

gafrdlibrary
عنوان الهيئة: القطعة رقم (210) بالقطاع الثانى-حى مركز المدينة-التجمع الخامس-القاهرة الجديدة- Email: [email protected] »

ابحث

تسجيل الدخول

عدد زيارات الموقع

1,477,013

اخر إصدارات كتب المكتبة