<!--<!--النقل الجيني في الأسماك

TRANSGENESIS IN FISH

By

                                                                                  <!--<!--                       

د. إبراهيم حسن إبراهيم

Dr. Ibrahim Hassan Ibrahim

Fish Genetics and Breeding Department

Central Lab for Aquaculture Research

Abbassa, Abou-Hammad, Sharkia, ARC, Egypt (Misr)

(2011)

النقل الجيني في الأسماك

Transgenesis in Fish

  أخذت الأسماك في السنوات الأخيرة قسطاً وافراً من الاهتمام لدى البيولوجيين لعدة أسباب:

<!--العدد الهائل لأنواع الأسماك.

<!--توافر عدد كبير من الدراسات الخاصة بالتطور والتكيف Adaptation عن الأسماك.

<!--وفرة إنتاج الأجنة بشكل كبير فى معظم أنواع الأسماك، وسرعة النمو نسبيا

<!--حدوث عمليات النمو والتطور الجنيني development تحت ظروف تجريبية بسيطة.

<!--إمكانية زراعة خلايا الأسماك من الأعضاء المختلفة فى ظروف بيئية معينة كما يحدث في النبات، وبالتالي إمكانية دراسة التعبير الجينى عليها.

<!--تمتاز الأسماك أيضاً بالنمو والتطور السريع، والإهتمام بها يأتى من كونها أحد مصادر البروتين الأساسية والبديلة لغذاء الإنسان.

لذا فإلقاء الضوء على عمليات نقل الجينات في الأسماك ربما تكون وسيلة فعالة جداً بالنسبة لهذه المميزات السابقة. فقد نجحت عمليات النقل الجيني gene transfer في كل أنواع الحيوانات مثل الثدييات والطيور والأسماك والحشرات والديدان. وقد تطورت عمليات نقل الجين في السنوات الأخيرة بشكل ملحوظ في الأسماك بالرغم من أن هذا النجاح ما يزال محدود.  

<!--ما هي الكائنات المعدلة الجينات أوالصفات الوراثية ؟

إنها النباتات، والحيوانات و الأسماك، والكائنات الدقيقة، والتى تحمل جينات لصفات
وراثية هامة من أنواع وفصائل أخرى؛ على سبيل المثال أسماك تحمل جينات أوصفات وراثية
من حيوان أو إنسان أو كائنات مجهرية، والعكس صحيح.  على هذا المنوال يتم خرق
أنظمة التناسل والتطور واندماج الخلايا. ولم تعد الحدود السابقة قائمة، حيث كان من
الممكن فقط التهجين بين العشائر من نفس النوع.

حيث يستخدم فى إنتاج هذه الكائنات المعدلة وراثيا، طرق عديدة مثل bombardment (إطلاق
القذائف(، وهى مقذوفات الجزيئات الميكروسكوبية من الذهب أو التنجستن المغطاة بمادة
الحمض النووي  DNAالذى يحمل الصفة الوراثية المطلوب إدخالها فى الخلايا الجنينية أو
الأجنة وحديثا يتم ذلك بتكنولوجيا النانو Nanotechnology.  هناك طريقة أخرى تستخدم ناقلات بيولوجية كالفيروسات أو البكتيريا لتحمل الصفات الوراثية الجديدة لحقن الجينات داخل الخلايا الجنينية أو الأجنة من خلال
كروموسوم اصطناعى، أو حتى تخليق حمض نووى تركيبى                        .synthetic recombinant DNA
<!--

<!--بعض طرق النقل الجيني في الأسماك: Methods of transgenesis in fish    

  يتم الإخصاب في معظم الأسماك خارجياً بشكل طبيعي، والكثير من الأجنه عند مرحلة معينة من النمو يمكن الحصول عليها بسهولة. ولهذا السبب تم اختيار الأسماك كمادة بيولوجية هامة للنقل الجيني. ففي بعض أنواع الأسماك فإن الأجنة تنمو بسرعة كبيرة، مما يجعل مرحلة الخلية الأولى first cell stage (قبيل الانقسام) قصيرة جداً لدرجة تسمح بحدوث gene transfer  بسهولة.

1- الحقن الدقيق Microinjection

<!--<!--في كثير من بيض الأسماك فإن الخلية تكون محاطة بغلاف (قشرة) من مادة الـ Chorion والتي تصبح صلبه بعد 30 – 60 ثانية من الإخصاب مباشرة على حسب نوع الأسماك ودرجة الحرارة وعوامل أخرى، وهى من المشاكل التي تواجه عملية الحقن.  فالماصات pipettes المستخدمة فى الحقن الدقيق Microinjection لا يمكنها أن تعبر هذا الحاجز (غلاف البيضة) بسهولة.  إن مادة الـ chorion في بعض الأنواع يمكن أن تستعيد نفسها (تلتئم مرة أخرى) withdraw ميكانيكياً أو إنزيمياً، ولكن هذا ليس ممكناً في أنواع مثل السالمون. كما أن بيئة التحضين الملائمة ربما توقف أو تبطئ من صلابة قشرة البيضة وتسهل عملية الحقن، لذا نجد أنه في بيض السالمون أجريت عملية وخز أو خدش pierced بقطعة زجاج حادة لتسمح للـ micropipettes بالوصول بسهولة إلى غشاء الخلية من خلال فتحة الميكروبايل دون غيرها.  وقد وجد أن حوالى 60-80% من البيض المحقون مقابل 90% من الغير محقون non-microinjected قد استكمل نموه حتى عملية الفقس hatching.

<!--<!--- في حالة أسماك البلطي tilapia فإن عملية الحقن مباشرة بعد الإخصاب تسمح بدخول DNA إلى سيتوبلازم الجنين، وقد وجد أن إضافة 0.5% من صبغة الفينول الأحمر مع محلول DNA يسهل عملية الحقن. وعلى العموم فإن بيض الأسماك يعتبر كبير نسبياً، ومادة الـ chorion فيه تفتقر إلى الشفافية لذلك من الصعب ملاحظة الـ pronuclei وجزئيات DNA المحقونة عبر هذا الغشاء.

- وفي الثدييات، تم إنتاج حيوانات محولة وراثياً بالحقن داخل النواة الأولية (قبل الانقسام) أو داخل الـ nucleus في مرحلة الـ two cells . أما عن عملية نقل الجينات داخل الأجنة عبر الخلايا الإنشائية الجنينية embryonic stem cell ، وكذلك الحقن المباشر للـ DNA داخل الخلية الأميه الذكرية spermatozoa قبل الإخصاب، فقد نجحت فى الفئران وقنافذ البحر ولم تنجح فى أسماك التراوت مثلا. وقد أثبتت التجارب التي أجريت حديثاً على بعض الجينات مثل الـ (chlroamphenicol acetyle transferase)   والـ (b-galactosidase)  والتى استخدمت ككاشف   marker ، أنه قد تم نقلها بكفاءة عالية إلى chicken spermatozoa ، حيث نجحت عمليات الاندماج والتعبير للـ DNA الغريب وتم انتقاله إلى النسل. وفيما يبدو أن هناك عوامل مساعدة لنجاح هذه العملية في الدجاج مثل استخدام محلول فسيولوجى buffer خاص يعمل على ثبات حيوية خلايا الـ spermatozoa، ووجد أن معظم النسل الناتج كان مبرقشا (mosaic).

حالة الموزايك هذه تحدث في الأسماك وأبو ذنيبة بنسبة عالية حيث يحدث تكرار سريع للحامض النووي الغريب (DNA exogenous) في المراحل المبكرة للتكشف الجيني. حيث نجحت نسبة كبيرة من DNA داخل السيتوبلازم في التعبير عن نفسها. في أسماك المبروك  carp، حيث لم يلاحظ اختلاف في كفاءة الحقن في مرحلتي التكشف (طور الخلية الواحدة، وطور الخليتين) وعلى هذا فقد تبين أن أفضل فترة لحدوث الاندماج هي المراحل المبكرة للجنين وخاصة مرحلة الخلية الواحدة، ومرحلة الخليتين أما في الأسماك القطية catfish (مثل القراميط) فإن المرحلة المتأخرة من one-cell والمرحلة المبكرة من الـ two-cells كانت هي المراحل المفضلة من البويضة المخصبة.

2- الثقب الكهربي Electroporation        

أما طريقة الثقب الكهربي electroporation فقد حصلنا منها على نسبة 25% من الأسماك المحولة والتي وصلت إلى عمر البلوغ ، ولكن 4% فقط نجح فى إنتاج زريعة fry كانت تحتوى على DNA غريب حيث نجح  في الانتقال إلى النسل الناتج من الفقس.

<!--<!--

<!--مصير الـ DNA المحقون:

The fate of the injected DNA

  أوضحت التجارب أنه بعد الحقن السيتوبلازمى مباشرة فإن قطع DNA الغريبة ترتبط بسرعة ببعضها مكونة ما يسمى large concatemers وهى تركيب حلقي كبير فى شكل سلسلة، والذي يتضاعف بسرعة بغض النظر عن أصل أوتتابع DNA الغريب، ويعتقد أن هذا نوع من الحماية لهذه الجزئيات من التحطم والتكسير. وقد لوحظ أن جزء كبير من هذا الـ DNA المتضاعف يتلاشى، وأن نسبة صغيرة منه قد تبقى حره أو تندمج داخل جينوم الخلية. وظاهرة التضاعف هـذه علـى ما يبـدو تحفـزها عملية الإخصاب، وتعتمد على تكوين تركيـب يشبـه النواة nucleus-like structure يحوى بداخلة الـ foreign DNA.  كما يعتمد معدل التضاعف replication في هذه الظاهرة أيضاً على الطبيعة الفراغية topology، وكذلك حجم DNA المحقون، وهذا التركيب الكبير concatemers وجد أنه أكثر فعالية وكفاءة لعملية تضاعف المادة الوراثية ، أيضاً وجد أن إتحاد fusion التراكيب شبيه النواه مع نواه الخلية أثناء التكشف الجنيني embryo development يسمح للـ DNA الغريب بالاندماج داخل جينوم العائل بطريقة عشوائية. هذه الظاهرة تحدث فى مرحلة متأخرة عن first cell stage لذا فهي تؤدى إلى non-uniform integration وبالتالي تنتج أفراد موزايك.

ففى الأجنة المبكرة لأسماك zebra fish وجد أن DNA المحقون قد تضاعف 10 مرات خلال 6-10 ساعات بعد الإخصاب، وأن نسبة صغيرة فقط من الـ DNA replicated هى التى بقيت واستمرت بعد مرحلة الجاسترولا (وهى مرحلة متقدمة من التطور الجنينى) وبالتالى فعملية بقاء أو وجود الـ DNA الغريب حراً غير مندمجاً فى شكل غير ثابت يساعدنا في تقدير العدد الحقيقي للأسماك المحولة وراثياً true transgenic fish.  ففي كل الأسماك المدروسة وجد أن جزئيات الـ DNA الغريبة (المراد إدخالها) قد ظهرت في شكل concatemers سريعاً بعد عملية الحقن الدقيق microinjection. وقد أمكن رؤية وملاحظة جزئيات الـ concatemers  في أسماك الـ zebra fish قبل بدء تضاعف الـ DNA. وفى الحقيقة فإن دراسة الكائنات الموزايك أوضحت أن خطوة الإدماج integration تحدث متأخرة (بعد) مرحلة الـ one – cell stage، ويمكن القول بأن مرحلة الإدماج يحتمل أن تحدث مباشرة خلال مراحل التكشف الجنينى embryo development.

<!--إنتقال الجينات الغريبة إلى النسل: Transmission of the foreign genes

  عند فحص إسبرم الأسماك المحولة وراثياً تأكد وجود جزئيات الـ DNA التى تم حقنها دليل على نجاح هذه المحاولات وإن كانت النسبة تختلف من نوع لآخر وعلى ذلك فقد تم إنتاج أسماك محولة وراثياً بتلقيح بويضات طبيعية مع اسبرم من ذكور أسماك محولة.

<!--<!--<!--<!-- 

وقد وجد أن نسبة الأسماك المحولة في الـ F1 أعلى فى أسماك التراوت (20-50%) من الأسماك المخططة zebra fish (7-30%). هذه النسبة المنخفضة من الأسماك المحولة في الجيل الأول F1 تثبت أن أباء هذه الأسماك progenitors كانت تحتوى على صفة  الـ mosaic في خلاياها الجنسية الأولية germ cells. وأثبت بعض الباحثين أن هذه النسبة إرتفعت في الجيل الثانى F2 وكانت 50% في أسماك zebra fish، بينما وصلت إلى حوالي 75% في أسماك التراوت، وعلى ذلك فإن إنتقال هذه الجينات يتبع السلوك المندلي في التوارث. أما في أسماك الـ medaka المحولة بطريقة الثقب الكهربى electroporation، كانت الدهشة حيث انتقلت هذه الجينات إلى الجيل الأول F1 بنسبة 100% وفى الجيل الثانى بنسبة 88%.

وعند تقييم تعبير الجينات المنقولة عن طريق الناتج البروتينى الخاص ببعض الأسماك وجد مثلا أن جين المقاومة للمضاد الحيوى neomycin نجح فى التعبير عن نفسه بشكل جيد عندما نقل إلى أسماك الـ gold fish . أما جين s-crystallin فقد عبر عن نفسه في خلايا عدسة العين في المراحل المبكرة من التكشف الجيني لأسماك الـ medaka. كذلك فالبروتين المانع لتجمد الخلايا قد عبر عن نفسه في خلايا كبد أسماك السالمون المحولة. ومن هذا يتضح وجود تخصص في التعبير الجيني أو ما يعرف بالتعبير الجيني المكاني spatial. وعلى كل فقد وجد أن اسماك المبروك المحولة والمنقول إليها DNA الخاص بهرمون النمو في التراوت كانت أسرع فى النمو من الكونترول وإنتقلت هذه الصفة إلى النسل. وعند وضع جين النمو للإنسان hGH gene مع بروموتر(تتابع نيوكليوتيدى يتحكم فى تشغيل الجين) من الفأر عبّر بمعدل عالي في أسماك التراوت عقب عملية الحقن. وقد أمكن الكشف عن وجود mRNA لجين النمو hGH عن طريق التحليل الجزيئى وهذا التعبير الخاص بجين النمو للإنسان اقتصر على المرحلة المبكرة فقط، ولم يظهر في الأسماك البالغة في التراوت ربما لكونه غير نقى التركيب heterogenous ولم يبدأ البداية الصحيحة للنسخ. هذا بالإضافة إلى أنه في معظم الحالات فإن جين الثدييات يكون مهيئاً أكثر للعمل داخل الثدييات وليس داخل خلايا الأسماك. إذاً يفضل نقل الجينات الهامة من الأسماك المتميزة إلى الأسماك المراد تحسينها مهما اختلف النوع لكى تعمل بكفاءة من قبل جهاز النسخ في الأسماك.

<!--<!--وقد استخدمت أنواع الخلايا السمكية لدراسة التعبير الجيني ومن بين هذه الخلايا، خلايا طبقة الجلد EPC من أسماك المبروك وخلايا المناسل gonads من أسماك التراوت، وخلايا الكبد من أسماك التراوت أيضاً.  وقد تم تحديد الظروف المثلى ودرجات الحرارة المنخفضة للخلايا حسب نوع الأسماك.

وقد استخدمت الطرق التقليدية للنقل بالعدوى transfection للجينات المراد نقلها للخلايا المنزرعة cell cultured وكانت جيده فى خلايا الأسماك. وقد أمكن الحصول على خلايا بها جينات مقاومة للمضاد الحيويpuromycin   ،  neomycin.  وعلى أي حال، ففي معظم الأحوال، كانت كفاءة الجين المشغل promoter الخاص بالثدييات تنخفض بشكل معنوي في خلايا الأسماك، ومشاكل أخرى ربما تأتى في بعض الحالات في خطوة ما بعد النسخ post-transcription. وعلى هذا فإنه لا بد من اختبار كفاءة الجين المركب في خلايا الأسماك قبل استخدامه لإنتاج transgenic fish.

<!--الخلاصة  :Conclusion

<!--أنه يمكن حقن DNA غريب حاملا لصفة وراثية هامة داخل نواة البويضة Oocyte أو بسهولة أكثر داخل سيتوبلازم الجنين في مرحلة الخلية الواحدة one-cell.

<!--أن المعدل العام للأسماك المحولة transgenic عالياً إلى حد ما بالمقارنة بالثدييات. ويساعد على ذلك العدد الكبير من الأجنة الذي تم معاملته.

<!--أن طريقة الثقب الكهربي electroporation أعطت إنتاجاً أعلى من الـ transgenic في بعض أنواع الأسماك، وهذا يلزم عند الاهتمام بالناحية التجارية.

<!--أنه من وجهة النظر العملية، فإن طريقة الـ electroporation  تستخدم على نطاق واسع في إنتاج transgenic في اللافقاريات المهمة تجارياً مثل القشريات (كالجمبري).

<!--أيضاً قد لوحظ من خلال التجارب، أن المعدل العالي للتعبير الجيني في الأسماك المحولة transgenic fish لم يلاحظ خلال هذه التجارب، لذا يمكن حل هذه المشكلة باستخدام الجين المناسب المحتوى على DNA من مصدر سمكي.

ومما لا شك فيه أن تقدم طرق نقل الجينات سيساعد بشكل كبير على تقدم نتائج هذه التجارب في الأسماك ، حيث يمكن الحصول على إنتاج عالي من الإناث كأمهات تهجين، وكذلك إنتاج عالي من الذكور بكفاءة عالية لأنواع عديدة من الأسماك وتثبيت صفات وراثية جديدة مثل تحمل البرودة وتحمل الملوحة ومقاومة الأمراض البكتيرية والفيروسية من خلال نقل الجينات. لذا يجب أن يكون المصدر الأول لتعزيز الأمن الغذائي في إقليم الشرق الأوسط هو زيادة الإنتاج من خلال إدخال الأصناف ذات الإنتاجية العالية أو المكيفة بصورة أفضل، وباستخدام أساليب استزراع وإدارة جيدة للمياه تتميز بكفاءة أكبر وبطريقة قابلة للاستدامة. كما أن هناك حاجة، بجانب زيادة الإنتاج، إلى تحسين النوعية كالقيمة الغذائية والربحية للناتج النهائى.

<!--<!--وتتيح التكنولوجيا الحيوية biotechnology الفرص لتجنب ضعف الأمن الغذائي والتدهور البيئي Environmental degradation. ومن شأن تكنولوجيات زراعة الأنسجة وأبحاث المادة الوراثية (DNA) أن تساعد على تخفيف المعوقات التي تواجه الزراعة وذلك، مثلا، بتوفير أصول خالية من الفيروس وأصناف محسنة مقاومة للإجهاد الحيوي واللاحيوي، biotic & abiotic stress أو تتميز بقيمة غذائية وإنتاجية عاليه. وتشمل تطبيقات التكنولوجيا الحيوية في مجال الإنتاج الحيواني، طرق الإكثار وإنتاج حيوانات التحول الوراثي المحسنة. ومن شأن التشخيص الجزيئي أن ييسر تحديد الآفات والأمراض، كما أن تكنولوجيات الكاشف الجزيئي تيسر تحسين السلالات التقليدية. كما أن التحسينات في علائق وتغذية الحيوانات هي أمور هامة بدورها.

إلا أن هناك اعتراضات على دخول هذه الأسماك للبيئة الطبيعية بحجة الخوف من اختلال التوازن البيئي Ecological imbalance وفقدان الأصول الوراثية الطبيعية رغم ماتحمله من صفات وراثية جديدة تسهم فى زيادة الإنتاج، ويرى البعض أنه يمكن تربية هذه الأسماك فى مناطق محددة حتى لايسمح لها بالاختلاط مع الأنواع الطبيعية.

تم بحمد الله وتوفيقه،

د/ ابراهيم حسن ابراهيم   E-Mail: [email protected]