أجريت هذه الدراسة في معمل الفسيولوجي والتكنولوجيا الحيوية بقسم إنتاج الحيوان- كلية الزراعة - جامعة المنصورة بالتعاون مع المركز الدولي للتدريب علي رعاية الحيوان - معهد بحوث الإنتاج الحيواني – مركز البحوث الزراعية - وزارة الزراعة خلال الفترة من فبراير 2008 حتى أكتوبر 2008. وقام تلك الدراسة الباحث/ وائل أحمد خليل رزق- عضو هيئة تدريس بكلية الزراعة جامعة المنصورة بجمهورية مصر العربية.والدكتور ربحي سعيفان من جامعه القاهره

* لجنة الإشــراف على هذه الأطروحة العلمية:

أ.د/ مصطفى عبد الحليم الحرايرى: أستاذ فسيولوجيا الحيوان - كلية الزراعة – جامعة المنصورة.

أ.د/عبد الخالق السيد عبد الخالق: أستاذ فسيولوجيا الحيوان - كلية الزراعة - جامعة المنصورة.

د/ شريف مغاوري محمد شاميه: باحث –  قسم التكنولوجيا الحيوية - معهد بحوث الإنتاج الحيواني.

وقد أجريت هذه الدراسة لتقييم:

1-     تأثيرأوقات مختلفة لحفظ المبايض علي درجة حرارة 25°م لمدة 5 ، 6 ، 7 ، 9 ، 12 أو 24 ساعة بعد الذبح علي معدل إسترداد ونوعية بويضات الجمال وحيدة السنام. تم جمع مبايض الجمال من المجزر الألي بالبساتين- القاهرة. تم جمع المبايض ووضعت بعد الذبح مباشرة في وعاء حفظ يحتوي علي محلول فسيولوجي (0.9% كلوريد صوديوم) مضاف إليه مضادات حيوية  علي درجة حرارة (25 °م) ثم تم نقلها للمعمل في خلال 5 ساعات. كانت المبايض تغسل ثلاث مرات بمحلول منظم الفوسفات الدافئ ومره واحده بالكحول الإيثيلي 70%. تم عد جميع الحويصلات المبيضية المرئية ذات القطر 2-8 مم الموجودة علي سطح المبيض. تم سحب البويضات بواسطة إبره ذات قطر 20. تم تسجيل محصول البويضات لكل مدة حفظ  وعدد البويضات لكل مبيض. كان يتم تقييم البويضات تحت الميكروسكوب وتقسيمها إلي 5 أنواع (بويضات جيدة - بويضات معراة جزئياً- بويضات معراة - بويضات غير صالحة - بويضات منقسمة).

2-     تم إنضاج البويضات المستردة من المبايض بعد 5 ساعات من الذبح معملياً في بيئة إنضاج مضاف إليها سيرم أجنة الجمال أو سائل حويصلي للجمال أو خليط بنسب مختلفه منهم وذلك لتحديد المستوي الأمثل من الإضافة والذي يؤثر علي معدل الإنضاج المعملي لبويضات الجمال. الإضافات كانت تحتوي علي المستويات التالية:

-         المستوي الأول: 10% سيرم أجنة الجمال.

-         المستوي الثاني: 7.5% سيرم أجنة الجمال + 2.5% سائل حويصلي للجمال.

-         المستوي الثالث: 5% سيرم أجنة الجمال + 5% سائل حويصلي للجمال.

-         المستوي الرابع: 2.5% سيرم أجنة الجمال + 7.5% سائل حويصلي للجمال.

-         المستوي الخامس: 10% سائل حويصلي للجمال.

3-             تم جمع عدد 23 خصيه من طلائق الجمال الناضجة من المجزر بعد الذبح مباشرة ووضعها في كيس بلاستيك في وعاء للحفظ علي درجة حرارة الغرفة أو في ثلاجه علي درجة حرارة 5°م ثم نقلت إلي المعمل وذلك في خلال 5 ساعات بعد الذبح تقريباً. في المعمل كانت تنزع الخصية من الغلاف  المصلي المحيط بها ثم تغسل بعد ذلك بماء الصنبور 3مرات وتغسل المرة الأخيرة بكحول إيثايل 70%. تم عمل تشريح في ذيل البربخ عن طريق مشرط وعن طريق الضغط علي هذه المنطقة يتم ظهور الحيوانات المنوية وجمعها عن طريق الشفط بواسطة سرنجه معقمه (5سم) محتوية علي 2مل من مخفف السائل المنوي. وضعت الحيوانات المنوية المستردة في إنبوب 15 مل. الحيوانات المنوية إستردت من الخصية المخزنة علي درجة حرارة الغرفة ودرجة حرارة الثلاجه علي فترات مختلفة ما بين الذبح  و إسترداد الحيوانات المنوية (6- 12-24 ساعه). بعد ذلك تم تقدير الصفات الطبيعية للحيوانات المنوية وهي النسبة المئوية لكل من ( الحركة التقدمية, الحيوانات المنوية الحية, و الشاذه, وذات الذيل الملتف تحت ظروف الأسموزية المختلفة).

4-     تم أيضاً دراسة تأثير أضافة مضادات الأكسدة الأنزيمية الجلوتاثيون بتركيزات 0.4 و 0.8 مليمول أومضادات الأكسدة الطبيعية حامض الأسكوربيك  بمستويات 0.5 و 1.0جم/لتر لمخفف الترس + صفار البيض  علي الصفات الطبيعية للحيوانات المنوية (المستردة من الخصية المحفوظة علي درجة 5°م لمدة 6 ساعات)  المخزنة علي درجة حرارة الغرفة (30°م) لمدة (0 ، 2 ، 4 ، 12ساعة) أو علي درجة حرارة الثلاجة (5°م) لمدة (0 ، 12 ، 24، 48 ساعه) ومقارنتها بالكنترول والذي لم يضف إليها أي إضافات.

5-     البويضات المنضجة تبعاً لأحسن النتائج  في تجربة الإنضاج المعملي  لبويضات الجمال (التجربة الاولي) والمستردة من المبيض بعد 5 ساعات من التخزين علي درجة حرارة 25 °م والتي تم إنضاجها في بيئة زراعة الأنسجة 199 والمضاف إليها 10% سيرم  تم  إخصابها معملياً بواسطة حيوانات منوية من البربخ (والمستردة من الخصية بعد 6 ساعات من التخزين علي درجة 5°م في مخفف الترس والذي يحتوي علي 0.4 مليمول جلاتثيون) وذلك تبعاً لأفضل النتائج المتحصل عليها من التجربة الثانية. تم زراعة البويضات المخصبة بعد الإخصاب في بيئة إستزراع لمدة 7 أيام.

عمل تجربة إخصاب وتطور معملي وذلك تبعاً لأفضل النتائج المتحصل عليها من التجارب السابقة.

يمكن تلخيص النتائج المتحصل عليها كالتالي:-

1. تخزين المبايض:

1. 1. تناقص متوسط عدد الحويصلات لكل مبيض ما بين 5-7 ساعات (14.1-10.9)، ومع ذلك أظهر عدد الحويصلات لكل مبيض إتجاه متقلب ما بين 9-24 ساعه من الحفظ.

1. 2. أظهر متوسط عدد البويضات لكل مبيض معدل تناقص عالي ما بين 5 و6 ساعات من 12.4 إلي 9.3 بويضه/مبيض وكذلك ما بين 9و12 ساعة من الحفظ علي التوالي.

1. 3. أظهر معدل إسترداد البويضات تناقص غير معنوي من 88.1% علي 5 ساعات إلي 78.6% علي 9 ساعات من الحفظ وكان هناك تناقص معنوي ((P<0.05 إلي 62% ما بين  9 و 12ساعه ثم تناقص غير معنوي إلي 58.6% بعد 24 ساعه من حفظ المبايض.

1. 4. كان التوزيع النسبي  ومعدل الإسترداد لأنواع البويضات أعلي بالنسبة للبويضات الجيدة وأقل للبويضات المنقسمة وذلك بالنسبة لكل أوقات الحفظ. بزيادة وقت التخزين كان هناك تناقص معنوي (P<0.05) للتوزيع النسبي للبويضات الجيدة والمنقسمة بينما يزيد التوزيع النسبي للبويضات المعراة جزئياً  والمعراة كلياً وغير الصالحة.

2. إنضاج البويضات:

2. 1. أظهرت النتائج أن إضافة 10% سيرم أجنة الجمال إلي بيئة الإنضاج أظهر أعلي توزيع نسبي للبويضات التي وصلت لمرحلة الإنقسام الميتوزي الثاني (59.5%) وأقل توزيع نسبي للبويضات  التي في مرحلة Germinal vesicle breakdown  والبويضات التي في مرحلة الإنقسام الميتوزي الأول (5.2% لكل منهم). علي الجانب الأخر بيئة الإنضاج المضاف إليها 10% سائل حويصلي أظهرت معنوياً أقل توزيع نسبي  للبويضات التي وصلت لمرحلة الإنقسام الميتوزي الثاني (25.7%) وأعلي توزيع نسبي  للبويضات  التي في مرحلة Germinal vesicle breakdown  والبويضات التي في مرحلة الإنقسام الميتوزي الأول (17.6% ، 16.9 % علي التوالي).

2. 2. إنه من الملاحظ أنه زيادة مستوي السائل الحويصلي في بيئة الإنضاج من 2.5 إلي 7.5% أدي إلي إنخفاض معدل الإنضاج (البويضات التي تصل إلي مرحلة الإنقسام الميتوزي الثاني) من 54.2 إلي 33.3% وهذا يشير إلي أنه ربما يكون هناك تأثير عكسي للسائل الحويصلي للجمال علي معدل الإنضاج المعملي لبويضات الجمال. وكان هذا أكثر وضوحاً بالنسبة لمعدل الإنضاج للبيئة المضاف إليها 10% سائل حويصلي حيث أظهرت أقل النتائج  بينما النتائج المتحصل عليها من خفض مستوي السائل الحويصلي إلي 2.5% أظهرت إختلافات غير معنوية مع أحسن النتائج للبيئة المضاف إليها 10% سيرم أجنة الجمال.

3. تخزين الخصية:

3. 1. علي درجة حرارة الغرفة (30°م):

3. 1. 1. كان تأثير وقت حفظ الخصية معنوي (P<0.05) علي الحركة التقدمية حيث كانت (61.67مقابل 43.33) ولم يكن هناك إختلافات معنوية بالنسبة لكل من نسبة الحي (54.33 مقابل 51.67 %)ونسبة الشواذ (19 مقابل 20%) للحيوانات المنوية المستردة من الخصية المحفوظة علي درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات ، 12 ساعة علي التوالي.

3. 1. 2. أظهرت الحيوانات المنوية للجمال المستردة من الخصية المحفوظة علي درجة حرارة الغرفة لمدة 6 أو 12 ساعة إستجابة متشابهة لإختبار الإسموزية المنخفضة (46.33 ، 46.87% علي التوالي).

3. 1. 3. أظهرت نسبة الحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي زيادة معنوية (P<0.05) من 20.1 إلي 69.78% بتناقص مستوي الإسموزية من 300 إلي 50 مللي إزمول/لتر.

3. 1. 4. لوحظت أعلي إستجابة للحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي بواسطة خفض الإسموزية من 200 إلي 150 مللي إزمول/لتر بينما كانت أقل إستجابة 100 و50 مللي إزمول/لتر.

3. 1. 5. كانت أعلي إستجابة للحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي تم تسجيلها للحيوانات المنوية المستردة من الخصية المخزنة لمدة 12 ساعه عند مستوي إسموزية 50 مللي إزمول/لتر حيث كانت 70% ، وكانت 51.87% عند وقت تحضين 30 دقيقه. وكانت 74.33 عند مستوي إسموزية 50 مللي إزمول/لتر عند وقت تحضين 30 دقيقه و 75.33% للحيوانات المنوية المستردة من الخصية بعد 12 ساعه من التخزين عند مستوي إسموزية 50 مللي إزمول/لتر عند وقت تحضين 30 دقيقه.

3. 2. علي درجة حرارة الثلاجة(5°م):

3. 2. 1. كان تأثير وقت الحفظ  معنوياً فقط علي نسبة الحيوانات المنوية الشاذة. ومع ذلك كانت نسبة الحركة التقدمية  ونسبة الحي للحيوانات المنوية غير معنوية بواسطة وقت الحفظ علي درجة حرارة ( 5 °م) بالرغم من أن هذه النسب تظهر تناقص تدريجي بواسطة زيادة وقت الحفظ من 6 إلي 24 ساعة. علي الجانب الأخر أظهرت نسبة الحيوانات المنوية الشاذة زيادة غير معنوية من 14% بعد 6 ساعات إلي 15% بعد 12 ساعة وزياده معنوية 25% بعد 24 ساعة من الحفظ علي درجة حرارة الثلاجة ( 5 °م).

3. 2. 2. من الملاحظ  أن معدل النقص في نسبة الحركة التقدمية  للحيوانات المنوية كان أعلي ما بين 6و 12 ساعه وكان أقل مابين 12و24 ساعه والعكس صحيح بالنسبة لنسبة الحيوانات المنوية الشاذة. بينما معدل النقص في نسبة الحي  كان متشابه تقريباً عند كل أوقات الحفظ.

3. 2. 3. أظهرت نسبة الحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي زيادة معنوية (P<0.05) من 19.23 إلي 76.95% بتناقص مستوي الإسموزية من 300 إلي 50 مللي إزمول/لتر.

3. 2. 4. لوحظت أعلي إستجابة للحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي بواسطة خفض الإسموزية من 200 إلي 150 مللي إزمول/لتر بينما كانت أقل إستجابة 100 و50 مللي إزمول/لتر.

3. 2. 5. كانت أعلي إستجابة للحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي تم تسجيلها للحيوانات المنوية المستردة من الخصية المخزنة لمدة 12 ساعه عند مستوي إسموزية 50 مللي إزمول/لتر حيث كانت 78.44% ، وكانت 55.20% عند وقت الإختبار 30 دقيقه. وكانت 81.33 عند مستوي إسموزية 50 مللي إزمول/لتر عند وقت تحضين 30 دقيقه و 82.33% للحيوانات المنوية المستردة من الخصية بعد 12 ساعه من التخزين عند مستوي إسموزية 50 مللي إزمول/لتر عند وقت تحضين 30 دقيقه.

4. إضافة مضادات الأكسدة:

4. 1. علي درجة حرارة الغرفة (30°م)

4. 1. 1. إضافة مضادات الأكسدة أدي إلي تحسين معنوي في نسبة الحيوانات المنوية الحية والنقص في نسبة الحيوانات المنوية الشاذة والحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي ولكن كان غير معنوي وذلك عندما كان يضاف إلي مخفف السائل المنوي مضاد الأكسدة الجلاتثيون بتركيز 0.4 مليمول. أيضاً حدث تحسن غير معنوي في نسبة الحيوانات المنوية الحيه  ونسبة الحيوانات المنوية الشاذة ونقص معنوي في نسبة الحركة التقدمية و نسبة الحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي لباقي مضادات الأكسدة.

4. 1. 2. إستخدام مضاد الأكسدة  الأسكوربيك بتركيز 1.0 جم/لتر أدي إلي زيادة معنوية في نسبة الحيوانات المنوية المتحركة  وكذلك ذات الذيل الملتوي بينما أدي إضافة الجلاتثيون بتركيز 0.4مليمول إلي تحسن في نسبة الشواذ ونسبة الحيوانات المنوية الحية.

4. 2. علي درجة حرارة الثلاجة(5°م):

4. 2. 1. أدي إضافة الجلاتثيون بتركيز 0.4مليمول إلي تحسن معنوي في كل خصائص الحيوانات المنوية المدروسة (نسبة الحيوانات المنوية الحية والحيوية والحيوانات المنوية ذات الذيل الملتوي) ما عدا نسبة الشواذ.

5. التطور المعملي لبويضات الجمال:

5. 1. أظهرت نتائج التطور المعملي لبويضات الجمال أن معدل الإنقسام كان 41.8% والتوزيع النسبي للأجنة في مراحلها المختلفة كان 5.45 ، 14.55 ، 16.36 ، 5.45% للأجنة المنقسمة إلي خليتين ، 8-16 خلية ، الأجنة في المرحلة التوتيه و مرحلة البلاستوسيست علي التوالي.

 الخلاصة:

1.         حفظ مبايض الجمال علي درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ساعات بعد الذبح علي درجة حرارة 25°م له أثر إيجابي علي جودة البويضات وكذلك معدل إستردادها مقارنة بمدد الحفظ الأخري حتي 24 ساعة.

2.         أظهر إضافة 10 % سيرم أجنة الجمال إلي بيئة الإنضاج المعملي أعلي توزيع نسبي للبويضات التي وصلت إلي مرحلة الإنقسام الميتوزي الثاني (59.5%).

3.         يمكن تخزين مخاصي الجمال لمدة 24 ساعة بعد الذبح علي درجة حرارة الثلاجة (5°م) دون التأثير علي خصائص الحيوانات المنوية.

4.                      إضافة مضادات الأكسدة الأنزيمية الجلوتاثيون 0.4مليمول مع مخفف الترس أظهر أفضل نتائج للصفات الطبيعية للحيوانات المنوية عند الحفظ علي درجة حرارة التبريد (5°م).

5.         تشير نتائج التطور المعملي لبويضات الجمال التي تم إنضاجها معملياً وإخصابها بواسطة حيوانات منوية مستردة من الخصية إلي معدل نجاح مرضي لإنتاج الأجنة معملياً.