الكشف والتوصيف الجزئى لبعض العدوى الفيروسية فى

أسماك وقشريات المياة البحرية

رسالة مقدمة من

ط.ب/ راندا يسرى السيد ثابت

لإستيفاء متطلبات الحصول على

درجة الدكتوراة

فى مكافحة أمراض الإستزراع المائى

معهد الإستزراع السمكى وتكنولوجيا الأسماك

جامعة قناة السويس

2019

لجنة الإشراف

أ.د. صلاح الدين مصيلحى على

أستاذ ورئيس قسم الباثولوجيا – كلية الطب البيطرى – جامعة قناة السويس والعميد السابق لمعهد الإستزراع السمكى وتكنولوجيا الأسماك –  جامعة قناة السويس.

د. شيماء محمد جلال منصور

أستاذ مساعد الفيرولوجيا – كلية الطب البيطرى – جامعة قناة السويس.

الملخص العربى

تشهد صناعة الجمبرى والأسماك فى مصر تقدماً مطرداً لتلبية متطلبات السوق خاصة فى المناطق الساحلية. حيث أن الإستزراع المائى فى الجمبرى والأسماك يشكل مصدراً هاماً وغنياً للبروتين والمغذيات الأخرى للاستهلاك الآدمي. وقد يؤثر خطر الإصابة بالفيروسات في مزارع الجمبري والأسماك بشكل سلبي كبير على إنتاج الاستزراع المائي. حيث لا يوجد سوي دراسات قليلة جدا في مصر على الأمراض الفيروسية في أسماك وقشريات المياه البحرية ؛ لذا كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تشخيص بعض الأمراض الفيروسية في الجمبري و الأسماك المصرية مثل IIV)NV و IHHNV و WSSV في الجمبري والـ LCDV في أسماك الدنيس البحري عن طريق الفحص الظاهري و النسيجي ومن خلال الطرق الجزيئية مثل : RT-PCR و PCR لتشخيص الحامض النووي الفيروسي في أنسجة عينات الجمبري المصابة بهذه الفيروسات، واختبار التتابعات الجينية و تحليل الشجر الجينية.

وتتقدم أيضا صناعة واستزراع الأسماك في مصر بشكل ثابت و سريع وذلك لمواجهة متطلبات السوق المحلى. لكن خطورة العدوى الفيروسية في المزارع السمكية قد تؤثر بشكل كبيرعلى إنتاجها. حيث أنه لا يوجد دراسات على فيروسات الأسماك في مصر، لذلك فان الهدف الرئيسي لهذه الدراسة هو التحري عن وجود وانتشار هذه الفيروسات في الأسماك المصرية وتطوير وسائل الكشف الجزيئية جديدة لتشخيص الحامض النووي الفيروسي في أنسجة عينات الأسماك المصابة بهذه الفيروسات.

ولتحقيق هدف هذه الدراسة ، تم جمع ٦٠ عينة جمبري و ٤٠ سمكة أسماك بحرية من منطقتين تقعان على ساحل البحر الأبيض المتوسط. المنطقة الأولى هي مثلث الديبة محافظة دمياط. المنطقة الثانية هي بحيرة بردويل ، محافظة شمال سيناء. هذه العينات تتضمن ٤٠ عينة جمبري مصابة و ٢٠ عينات من سمكة الدنيس بها شك بأن تكون مصابة بالمرض.

          تم الكشف عن جميع عينات الجمبري وسمك الدنيس للفحص الظاهري وأيضا لفحص الأنسجة المرضية وتم فحص العينات المشتبه بها من أجل فحص تأثير الفيروسات على الخلايا حيث تم حفظ جزء من أنسجة الجمبري في محلول Davidson لفحص الأنسجة المرضية للجمبري وتم جمع جزء أخر من عضلات الجمبري لإجراء الكشف الجزيئي لـ IMNV و IHHNV و WSSV وأيضا تم حفظ جزء من أنسجة سمكة الدنيس البحرية في ١٠ من محلول الفورمالين لفحص أنسجة الأسماك المرضية والجزء الآخر من الزعانف والجلد من سمك الدنيس لإجراء الكشف الجزيئي لـ LCDV.

يظهر النسيج العضلي في الجمبري المصاب بفيروس IMNV أبيض اللون، تكون معظمها في منطقة البطن ومنطقة الذيل مما يعطي مظهرا للجمبري كأنه مطبوخ. لذلك، تم استخدام هذه العلامات التشريحية للتشخيص المبدئي لمرض IMN.

وأيضا ارتبط الجمبري المصاب بفيروس IHHNV بمتلازمة تشوه الرانش أو تشوه الجزء الأمامي من قشرة الرأس الخارجية (RTS)، مما تسبب في انخفاض كبير في معدل النمو. يظهر الجمبري المصاب بعضلات عضلية معتمة وذات نقط حبيبية بيضاء على بقعة من القشرة الخارجية، خاصة عند المنطقة التي تربط الرأس مع البطن مع الاختلاف في الحجم.

بينما أظهر الجمبري المصاب بفيروس الندب البيضاء WSSV بقشرة خارجية رخوة ويمكن فصلها بسهولة عن البشرة الداخلية مع وجود العديد من البقع البيضاء المرئية المتناثرة الظاهرة على السطح الخارجي والأكثر وضوحا على السطح الداخلي مع بعض التشوهات في القشرة الخارجية والعضلات غير الشفافة.

تظهر أسماك الدنيس البحرية المصابة بفيروس LCDV بصورة ظاهرية مميزة للعدوى وهي أورام ليفية متعددة البقع البيضاء أو الدائرية حيث توجد هذه الأورام على الجلد والزعانف والعينين والفم يمكن اكتشافها بسهولة بالعين المجردة. يعتمد تشخيص هذا المرض الفيروسي بشكل عام على مراقبة الجلد. وقد شوهدت أورام كثيرة في جميع أنحاء الجلد خاصة في الزعانف الصدرية والظهرية والذيلية.

تم إعداد أنسجة الجمبري لصبغها بصبغة H&E لفحص الأنسجة المرضية للتحقق من التغيرات النسيجية في الجمبري المصاب. وأظهرت العضلات الهيكلية تلف في البطن و والمنطقة الصدرية البطنية. أظهر الفحص النسجي المرضي تغيرات مثل تلف الأنوية، وارتشاح وتخثر الخلايا والالتهاب الليفي في العضلة الهيكلية للجمبري المصاب بفيروس IMNV كما وجد أيضا الـ bodies inclusion داخل السيتوبلازم لخلايا العضلات.

يوفر الفحص النسيجي لظاهرة النوى الداخلية نوع Cowdry A تشخيصا مؤقتا للعدوى الفيروسية IHHNV. توجد جسيمات مميزة لفيروس IHHNV وهي جسيمات ذات صبغة بنفسجية وتظهر غالبا داخل نواة مبطنة بالكروماتين وتم تسمية التغيرات النسيجية في أنسجة الجمبري المصاب بانحلال خلوي واسع الانتشار، وتضخم شديد في النواة. أظهرت العضلات البطنية المتأثرة تليفا حاداً يسمي بـ Zenker.

أما عن نتائج الفحص الباثولوجي لأنسجة الجمبري المصاب بفيروس WSSV توجد أجسام نووية محبة للصبغات القاعدية في أنوية الخلايا مغلفة بمادة الكروماتين في الأنوية المتضخمة مع وجود تجاويف في الأنسجة ككل مع وجود تكسير وزيادة ارتشاح للخلايا الليمفاوية بها.

وأظهر الفحص النسيجي لسمك الدنيس المصاب بفيروس LCDV وجود جسيمات داخل السيتوبلازم، وتضخم النواة والتضخم الخلوي بالإضافة الى إلى ذلك، لوحظ وجود تحوصل هلامي سميك يحيط بالأورام الليفية المتضخمة.

لضمان أن عينات الجمبري التي تم جمعها مصابة بفيروسات IMNV, IHHNV و WSSV تم استخراج الحمض النووي RNA والحمض النووي DNA مباشرة من العينات التشريحية المجمعة وتحليلها مع بادئات محددة لفيروس IMNV باستخدام RT-PCR وكذلك لفيروسات IHHNV و WSSV باستخدام طريقة PCR. أعطت نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) منتجاً متوقعا عند جزء ١٣٩، ٨١، ٤١٤ bp بواسطة الجيل باستخدام جهاز الفصل الكهربائي، على التوالي. تم الحصول على هذه النتيجة من عينات الجمبري الإيجابية التي تم تاكيدها من قبل من خلال التشريج المرضي. تمثل هذه العينات عزلات من موقعين جغرافيين فى مصر بما في ذلك مثلث الديبة وبحيرة البردويل.

للتأكد من أن العينات التي تم جمعها من سمك الدنيس مصابة بفيروس LCDV تم استخراج الحمض النووي مباشرة من العينات التشخيصية المجمعة وتحليلها مع بادئات محددة لفيروس LCDV في طريقة PCR. أعطت نتائج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) منتجاً متوقعاً عند جزء ٤٠٥ bp بواسطة الجيل باستخدام جهاز الفصل الكهرباني. تم الحصول على هذه النتيجة من عينات إيحابية لسمك الدنيس البحري التي تم تأكيدها من قبل من علم التشريح المرضي. تمثل هذه العينات عزلات من موقعين جغرافيين في مصر بما في ذلك مثلث الديبة وبحيرة البردويل.

كانت نتائج الـ PCR الإيجابية في عينات الجمبري وأسماك الدنيس المصابة تقييم للخصائص الوراثية للفيروسات عن طريق تسلسل التتابعات أو النوكليوتيدات وتحليل هذه التسلسلات مع تسلسلات نيوكليوتيدية أخرى ذات صلة على الجين بنك. ترتبط عينات IMNV  بتسلسل عينات IMNV من الولايات المتحدة الأمريكية والبرازيل وإندونيسيا بنسبة تشابة 80.3 – 83.6، وترتبط عينات IHHNV بتسلسل عينات IHHNV من مصر والصين وكوريا وفيتنام وتايوان والإكوادور بنسبة تشابه 97.7 – 100% ترتبط عينات WSSV بتسلسل عينات من مصر وكوريا وتايوان بنسبة تشابة 95 – 100% ، أما في أسماك الدنيس البحري، ترتبط عينات LCDV بتسلسل عينات من كوريا وكندا والولايات المتحدة الأمريكية وتونس وإسرائيل بنسبة تشابة 80 – 89.7%.

من النتائج التي تم الحصول عليها يمكننا أن نستنتج أن IMNV و IHHNV و WSSV فيروسات تصيب الجمبري المصري وتنتشر بين أنواع الجمبري المختلفة في المحافظات الساحلية وأن LCDV فيروس يصيب الأسماك البحرية المصرية خاصة أسماك الدنيس البحري.

*** للإطلاع يرجى زيارة مكتبة الهيئة ***

إعداد : أيمن عشرى

إشراف : منى محمود